四种基因甲基化特异性pcr引物设计探讨

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1、四种基因甲基化特异性PCR引物设计探讨作者：林江，姚冬明，钱军，许文荣，钱震，朱照辉，陈芹，王雅丽，肖高飞【摘要】目的：对甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR，MSP)引物设计进行探讨。方法：使用MethylPrimerExpressSoftwareVersion1.0软件、“methprimer”和“MSPprimer”的网上在线软件设计的引物以及参照国外文献的MSP引物对CCAAT/增强子结合蛋白ζ（CEBPζ），CCAAT/增强子结合蛋白δ（CEBPδ）、脆性组氨酸三联体（FHIT）和死亡相关蛋白激酶（DAPK）

2、基因启动子进行MSP扩增，然后对其MSP产物进行测序验证以比较MSP引物设计的可靠性。结果：对于CEBPζ，CEBPδ，FHIT和DAPK启动子基因所设计的MSP引物经MSP后均获得了所需要的目的条带，但经测序鉴定MethylPrimerExpress和methprimer设计的CEBPδ，CEBPζ1的MSP扩增产物为假阳性产物，而MSPprimer设计的CEBPζ2的MSP产物为正确序列。结论：MSP引物设计的质量是保证MSP扩增成功的关键因素。【关键词】甲基化特异性PCR；引物；设计［Abstract］Objective:Tostudyth

3、eprimerdesignofmethylationspecificPCR(MSP).Methods：ThePrimerofMSPwas1designedusingthesoftwareofMethylPrimerExpressSoftwareVersion1.0,theonlinesoftwareof“methprimer”and“MSPprimer”toamplifyCEBPζ,CEBPδ,FHITandDAPKgenepromoters.TheMSPassaywasestablishedtodetectthemethylationstatu

4、softhesepromoters.ThentheMSPproductswereanalyzedinelectrophoresisandsequenced.Results：Theexpectedbandswereallobtainedforallfiveprimersets.ButsequencingrevealedthatamplificationproductsusingCEBPζ1andCEBPδprimersdesignedwithMethylPrimerExpressSoftwareandmethprimerwerefalseposit

5、ive,amplificationproductsusingCEBPζ2primersdesignedwithMSPprimer,FHITandDAPKprimerswerecorrect.Conclusion：QualityofdesignedprimerswasthevitalfactorforthesuccessfulofamplificationofMSP.［Keywords］methylationspecificPCR；primer；designDNA甲基化作为表观遗传学调控方式之一，在X染色体失活、基因组印记、DNA修复和基因表达调控

6、等方面发挥着重要的作用［1］。DNA甲基化主要是指在CpG二核苷酸中胞嘧啶环的第5位碳原子上以共价键的形式结合上一个甲基基团，形成5甲基胞嘧啶（5mC），而基因组的某些特定区域由于富集CpG寡核苷酸则形成了CpG岛（CpG2island，CGI）。约50％～70％的人类基因启动子区含有CGI，而在胚胎形成及正常组织中多数CGI是低甲基化的，但在正常组织细胞的定向分化过程中一些关键基因的甲基化可能发挥着重要的调控作用［2］，而在肿瘤细胞的演变过程中一些抑癌基因则发生了高甲基化（hypermethylation）并导致基因转录活性改变，这些改变已被证

7、实与肿瘤的发生发展密切相关［3］。目前甲基化特异性聚合酶链反应(methylationspecificPCR,MSP)已被广泛用来研究启动子的甲基化状态。然而，MSP扩增常会产生假阳性结果，导致国际上报道同一基因在同一种肿瘤中异常甲基化的发生率差异极大［4］。因此我们针对MSP的引物作了一些探讨性研究。1方法1.1DNA提取与修饰取胎盘组织DNA标本1μg/100μl，按CpGenomeTMDNA修饰试剂盒（Chemicon公司，加拿大）说明书进行亚硫酸氢盐修饰，经甲基化酶M.SssI处理后再修饰和不经过M.SssI处理直接修饰的DNA分别作为甲

8、基化和未甲基化的阳性模版。31.2MSP检测选择4个基因：CCAAT/增强子结合蛋白ζ（CEBPζ）启动子序列(NCBI序列号NM_00