千斤拔黄酮抑制血栓形成机制研究

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1、千斤拔黄酮抑制血栓形成机制研究作者：张明秋关铭年晓莉李淑梅张继梅【摘要】目的探索千斤拔黄酮抑制血栓形成及机制。方法50只Wistar雄性大鼠随机分为5组，分别为空白对照组(NC)、模型组(MC)、丹参组(SAM)、千斤拔黄酮高剂量组(FPH)和低剂量组(FPL)，每组10只。NC与MC组生理盐水10ml/kg灌胃;SAM组丹参液10ml/kg(相当于丹参生药0.1g/ml)灌胃;FPH组和FPL组按体重10ml/kg(相当于千斤拔生药1.2g/ml、0.3g/ml)灌胃。各组连续灌胃7d，1次/d。末次灌胃后除NC组外，其他各组大鼠制备股动脉血栓模型，并于模型制备后继续灌胃7d

2、。第7天灌胃1h后分别对各组大鼠腹主动脉采血，进行血小板聚集率检测，对MC组和FPH组分别用ELISA法进行GMP140、tPA、PAI1含量测定。结果FPH组与MC组比较，血小板聚集率均明显降低(P<0.05，P<0.01);GMP140基本保持基础水平，而MC组增高(P<0.05);tPA均有不同程度增高，但FPH组增高显著(P<0.05)，FPH组血浆PAI1降低，MC组PAI1增高(P<0.05)。结论千斤拔黄酮具有抑制血栓形成作用，其机制主要抑制血小板活化和促进纤溶作用。【关键词】千斤拔黄酮;血小板聚集率;GMP140;tPA

3、;PAI18以往研究表明，中药活血化淤方案在预防和治疗血栓性疾病中起重要作用，其机制是通过抗血小板聚集、抗凝血酶、降解纤维蛋白原、溶解纤维蛋白来实现的。千斤拔黄酮是天然的黄酮类化合物之一，本文通过千斤拔黄酮对血栓模型大鼠的血小板聚集率、血小板α颗粒膜蛋白(GMP140)、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)及I型纤溶酶原激活物抑制因子(PAI1)含量的影响，探讨千斤拔黄酮对血栓形成的抑制作用及机制。　　1材料与方法　　1.1动物Wistar雄性大鼠50只，体重为180～250g，均为雄性，由吉林大学实验动物中心提供。随机分为空白对照组(NC)、模型组(MC)、丹参组(SAM)、

4、千斤拔高剂量组(FPH)和低剂量组(FPL)，每组10只。　　1.2方法　　1.2.1试剂与仪器千斤拔水提物(提取条件按萃取优化工艺进行);二磷酸腺苷(ADP)，Sigma公司;丹参片(上海雷允上药业有限公司，每片含生药1g);枸橼酸钠(分析纯，北京化工厂);聚维酮碘溶液(吉林省明星医用消毒药械厂);注射用青霉素钠(160万U，华北制药股份有限公司)。GMP140、tPA及PAI1含量测定(ELISA)全套试剂盒(上海太阳生物技术公司)。LBYNJ2全自动四通道血小板聚集仪LDZ582低速离心机(北京医用离心机厂);WFJ720B型可见分光光度计〔尤尼柯(上海)仪器有限

5、公司〕;光学显微镜(长春第一光学仪器厂)。超低温冰箱MDF382ETECANSunrisebasic酶标仪(奥地利)。　　1.2.2实验步骤NC与MC组生理盐水10ml/kg灌胃;SAM组丹参液10ml/kg(相当于丹参生药0.1g/ml)灌胃;FPH和FPL组按体重10ml/kg(相当于千斤拔生药1.2g/ml、0.3g/ml)灌胃。各组连续灌胃7d，1次/d。末次灌胃后除NC组外，其他各组采用银针钳夹法制备动脉血栓模型。具体方法：将大鼠绑缚在大鼠固定台上，用聚维酮碘消毒并备皮后，利多卡因0.5ml/只注射于左后肢麻醉，切开左后肢表皮，分离股动脉，用镊子剥离股动脉，将银针

6、刺入股动脉血管，深度为10mm，并用镊子在刺有银针的血管处从不同角度轻轻钳夹，以造成血管内膜损伤，然后拔出银针，按压止血，缝合切口并注射青霉素预防感染。并于模型制备后继续灌胃7d。第7天灌胃1h后分别对各组大鼠腹主动脉采血。实验前将MC组和FPH组大鼠经右颈动脉采血0.9ml，实验后取腹主动脉血0.9ml以2%EDTANa2(血与抗凝剂之比为9∶1)，3000r/min离心10min，收集上层液，-80℃保存待测。　　1.2.3检测指标大鼠腹腔主动脉取血1ml注入盛有3.8%枸橼酸钠溶液试管中(血与抗凝剂之比为9：1)轻轻摇匀，采用LBYNJ2血小板聚集仪，以1500r/mi

7、n离心5min，吸取上清液为富血小板血浆(PRP)，放置于8×8方形杯中置恒温孔中备用;余血继续以30008r/min离心10min，吸取上清液为贫血小板血浆(PPP)。取200μlPPP放入方形杯中用以调零，取200μlPRP加入盛有搅拌子的方形杯中，PPP调零后，取出PPP方形杯，放入PRP方形杯，待显示血小板读数后，加入终浓度为5×10-4mol/LADP11μl可获得1、3和5min血小板聚集率(PAG)及最大血小板聚集率(MPAG)数值。采用经典酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA