btla 在t细胞上的表达和功能

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1、BTLA在T细胞上的表达和功能作者：王月颖,王雪峰,张学光,顾宗江【摘要】　　目的:研究BTLA（BandTlymphocyteattenuator）在T细胞上的表达和功能。方法:分离纯化人外周血T细胞,流式细胞术检测BTLA在不同T细胞亚群上的表达。进一步用CD3抗体分别和游离、包被以及抗Fc段二抗交联的BTLA激发单克隆抗体（mAb）或HVEMFc融合蛋白共同刺激T细胞活化,MTT检测细胞增殖。结果:BTLA组成性表达于CD3+、CD4+和CD8+T细胞表面。游离的BTLAmAb和HVEMFc融合蛋白均不能抑制CD3刺激的T细胞

2、增殖,然而包被和交联后的BTLAmAb和HVEMFc融合蛋白则能够明显抑制T细胞增殖。结论:BTLA的活化能显著抑制CD3抗体所活化的T细胞的增殖。【关键词】BTLA;共刺激分子;抑制;T细胞　　T细胞的活化依赖于双信号的共同刺激。T细胞受体（TCR）识别抗原提呈细胞（APC）上抗原肽MHC复合体,启动了T细胞活化的第一信号;APC上共刺激分子与T细胞膜上相应受体结合则提供了T细胞活化的第二信号。第二信号既包括增强T细胞反应的正性信号,也包括抑制T细胞反应的负性信号。CD28是促进T细胞初始活化的重要共刺激分子,能够增进IL2的合成,

3、维持T细胞反应;与之相反,CTLA4抑制T细胞活化,然而,9它们都与表达在APC表面的B71和B72结合［1］。CD28家族另外一个刺激分子ICOS与B7h结合,增强效应T细胞的反应［2］。PD1是继CTLA4之后发现的负性共刺激分子,具有两个配体PDL1和PDL2［3］。BTLA（BandTlymphocyteattenuator）是CD28家族新近发现的负性共刺激分子［4］。BTLA-/-T细胞对CD3mAb刺激的增殖较野生型T细胞更敏感［5］。与其他家族成员不同,BTLA的配体不属于B7家族成员,而是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家

4、族的HVEM［6］。值得一提的是,HVEM与TNF家族配体LIGHT结合能增强T细胞活化［7］,然而,HVEM与BTLA结合却产生抑制T细胞的作用［8］,因此HVEMBTLA是一对比较特殊的信号分子。　　1材料和方法　　1.1材料　　淋巴细胞分离液Ficoll(上海生化试剂二厂);96孔细胞培养板（Costar公司）;RPMI1640培养基（Gibco公司）;胎牛血清FCS（杭州四季青公司）;激发型CD28mAb和BTLAmAb8H9均为本室自行研制;CD3激发型抗体（BeckmanCoulter）;人HVEMFc融合蛋白（R&am

5、p;D公司）;PE标记鼠抗人BTLA抗体（eBioscience）;FITC标记鼠抗人CD4和CD8抗体（eBioscience）;羊抗鼠Fc段抗体和羊抗人Fc段抗体（crosslink抗体,Bethyl公司）;人T细胞阴性分选试剂盒（StemCellTechnologies）。二氧化碳培养箱（Jouan公司）;9流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）。　　1.2方法　　1.2.1外周血T细胞分离及纯化　　采集健康志愿者外周全血,经Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞（PBMC）,进一步按人T细胞阴性分选试剂盒说明书方

6、法,磁珠分离T细胞,检测T细胞纯度96%。　　1.2.2流式细胞检测BTLA在T细胞的表达　　分离纯化的T细胞用PBS洗涤后重悬于100μLPBS中,加入PE标记鼠抗人BTLA抗体、FITC标记鼠抗人CD4、CD8抗体,4℃作用30min,洗涤后上流式细胞仪检测。　　1.2.3T细胞的活化　　用CD3抗体分别和不同浓度的8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG共同包被96孔板,4℃过夜,用PBS洗涤;或CD3抗体包被过夜后加入不同浓度的游离8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG。将分离纯化的T细胞密度调整为1×109/L,每孔加

7、入100μ9L。在抗体交联实验中,96孔板CD3抗体包被过夜后,加入不同浓度的游离8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG,继而加入T细胞,置于37℃、50mL/LCO2培养箱中孵育1h,然后加入抗Fc段抗体,37℃、50mL/LCO2培养箱中继续培养。　　1.2.4T细胞增殖检测　　刺激活化的T细胞培养3d,于培养的最后4h加入20μLMTT溶液（5g/L）继续培养,吸取上清,加入100μL酸化异丙醇彻底溶解结晶,用酶标仪A570波长比色。　　1.2.5统计学分析　　数据用平均值x±s表示。两组样本均数的比较采用t检验,以P<

8、;0.05为有统计学意义。　　2结果　　2.1BTLA在静止T细胞上的表达　　流式细胞术检测显示,BTLA组成性表达于静止T细胞上。大约84%CD3+T细胞上表达BTLA,CD4+T上的表达高于CD8+T,