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时间:2018-08-01
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1、免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌作者:周义正李向阳杨锦红【关键词】阳性 金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引发社区感染和院内感染的重要致病菌,其所致感染常以急性、化脓性为特征。以其引发菌血症而致的脓毒血症最为严重。作者采用免疫捕获PCR法(ImmunocapturedPCR,icPCR)检测S.aureus,即应用抗体包被微量PCR管免疫捕获阳性血培养瓶中的S.aureus,再用PCR法快速检测ssa基因和mecA基因,以期建立一种快速准确地检测阳性血培养瓶中S.aureus的方法。 1材料与方法 1.1材料本实验所用的标准菌株均购
2、自卫生部临床检验中心,其它非标准菌株是本实验室保存的临床菌株,均分离自患者的血培养标本并得到Vitek-32全自动细菌鉴定仪的鉴定。引物:(1)ssa基因:ssa-F:5'-TCGGTACACGATATTCTTCAC-3',ssa-R:5'-ACTCTCGTATGACCAGCTTC-3'[1]。(2)mecA基因:mecA-F:5'-GCTAGAGTAGCACTCGAATTAGGC-3'mecA-R:5'-GATTGAAAGGATCTGTACTGGGT-3'。6 1.2方法(1)抗体包被微量PCR管:人IgG以0.1mol/L的Na2CO3缓冲液(pH=9.
3、6)稀释至20μg/ml,取500μl加至0.6ml的PCR管中37℃孵育3h,再放置4℃过夜,然后倒掉包被液,加入500μl10%小牛血清在37℃孵育1h,最后以PBST洗3次,包被好的PCR管置4℃冰箱备用[2]。(2)免疫捕获和模板DNA制备:以无菌方式抽取阳性血培养瓶中的带血球菌液置无菌试管以2,000r/5min离心,取500μl上层菌液加入包被有人IgG的PCR管中在37℃孵育30min,然后倒掉菌液以PBST洗涤6次,每次2min,最后在吸水纸上扣干残液,以上完成免疫捕获,接着在捕获完后的PCR管中加入100μl双蒸水并在PCR仪上以99.9℃裂
4、解10min,然后参照《精编分子生物学实验指南》上的醋酸钠-异丙醇法[3]沉淀DNA并用70%乙醇洗涤,待自然干燥后加入10μl双蒸水即得到PCR反应所用的模板DNA。(3)PCR扩增反应体系和参数:反应体系包括10×Buffer5μl,2.5mmol/LdNTP4μl,Taq酶1U,20μmol/L正反向引物各1μl,25mmol/LMgCl23μl,模板DNA10μl,最后补ddH2O至50μl。ssa基因和mecA基因的PCR扩增参数如下:先94℃预变性5min,再按94℃,30s→53℃,30s→72℃,1min,共35个循环;最后72℃6,10min
5、。目的基因片段大小分别为180bp和210bp。(4)最低检测限检测:先将在绵羊血琼脂平板上生长24h的S.aureus(菌株ATCC43300)纯菌落用无菌蒸馏水调置成1McFarland的菌液,然后以无菌操作方式将调好的1ml菌液加入血培养瓶中,再以无菌操作方式将5ml正常人无菌血加入同一血培养瓶中,最后将血培养瓶放入BacT/Alert全自动血培养仪直至阳性报警,接着以无菌操作方式从阳性血培养瓶中抽取5ml置无菌试管中2,000r/5min离心,再取上层菌液3ml作原始菌液并以新血培养瓶中的无菌培养液10倍系列稀释观察icPCR的最低检测限,每个稀释度做
6、5管,重复试验3次,原始菌液和各稀释菌液均以琼脂倾注法作活菌记数。(5)特异性试验:按照与最低检测限检测中相同的方法用表1中1-20号菌株制作模拟标本,分别用icPCR法检测ssa基因和mecA基因以鉴定S.aureus和MRSA,重复试验3次。(6)临床标本检测:以本实验室2006年7至8月收到的血培养标本中的106例阳性报警瓶为检测对象,分别采用传统方法和icPCR法进行检测S.aureus和MRSA。 2结果 以菌株ATCC43300为试验菌株的最低检测限检测显示,icPCR法检测阳性血培养瓶中S.aureus的ssa基因和mecA基因的检测限均在4
7、.3×104cfu/ml左右。icPCR法在10例由S.aureus模拟的阳性标本中检测到ssa基因,其中有6例还检测到mecA基因;其它10例非S.aureus模拟的阳性标本中均未检测到ssa基因和mecA基因。传统方法在106例阳性报警瓶中检测到9例S.aureus,其中3例S.aureus的苯唑西林MIC≥4μg/ml;icPCR法检测到的S.aureus与传统方法的结果相同,但在1例苯唑西林MIC仅为2μ6g/ml的S.aureus中也检测到mecA基因。若以传统方法为金标准,icPCR法检测阳性血培养瓶中S.aureus的灵敏度和特异度均达100%。
8、此外,用传统方法检测阳性报警瓶中S.a
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