去势大鼠骨髓细胞cd44的表达及其意义

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1、去势大鼠骨髓细胞CD44的表达及其意义【摘要】目的：观察CD44在去势大鼠骨髓细胞中的表达情况，探讨CD44对大鼠去势后骨髓细胞分化的作用和意义。方法：采用免疫组织化学方法，观察CD44在SD大鼠去势后4周、8周、12周骨髓细胞中的表达。结果：CD44在去势组和对照组中均有表达，CD44阳性染色主要见于单核细胞融合的多核巨噬细胞/破骨样细胞中，去势后各组动物骨髓细胞CD44表达均显著高于对照组。结论：CD44可能参与大鼠去势后骨髓细胞的分化，可能在骨髓单核细胞向破骨细胞分化中发挥重要作用。【关键词】CD44;去势;破骨

2、细胞8骨质疏松是常见的老年病之一。骨质疏松症是以骨量下降，骨组织显微结构褪变，骨脆性增加、骨强度降低为特征的一种全身性疾病。骨形成和骨吸收的失衡是其主要病理特征。破骨细胞属于单核/巨噬细胞谱系细胞，受多种调控因子的直接或间接调控，经增殖、分化、融合发育成为多核的成熟的破骨细胞[1]，破骨细胞的形成与分化在骨形成和骨吸收失衡过程中发挥直接作用。CD44是重要的细胞黏附分子，在多种细胞中均有表达，参与细胞与细胞之间或细胞与细胞外基质之间的相互作用，具有多种功能。目前研究发现，CD44在破骨细胞或巨噬细胞的形成和功能调节中具

3、有重要作用[2-4]。因此，本文通过研究SD大鼠去卵巢后骨髓细胞CD44表达的变化情况，探讨CD44在骨髓细胞分化过程中的意义，为深入研究骨质疏松症的发病机制提供线索。　　1材料与方法　　1.1药品与试剂　　多聚甲醛、EDTA、TritonX100等购自sigma公司;CD44抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。　　1.2仪器　　OLYMPUS显微镜(日本);石蜡切片机(德国LEICA);ImageProPlus图像分析软件(美国MediaCybernetics公

4、司)　　1.3动物　　健康3月龄雌性SD大鼠，200±50g，由四川大学华西实验动物中心提供。　　1.4方法8　　1.4.1动物模型　　3月龄雌性SD大鼠28只，体重200±50g，随机分成4组，分别为去势(Ovariectomy，OVX)4周组、去势8周组、去势12周组和假手术组(Shamoperation，SX)，每组7只。经2%戊巴比妥钠(40mg·kg-1)腹腔麻醉后，OVX组进行双侧卵巢切除手术，SX组只进行单纯的开腹、关腹手术。术后各组动物分笼饲养，自由摄食饮水。各组动物分别于术后4周、8周、12周，经2%

5、戊巴比妥钠(40mg·kg-1)腹腔麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，取L5椎骨，EDTA脱钙，常规石蜡包埋，制作7μm石蜡切片，进行HE染色和Masson三色染色，分析骨小梁变化情况。　　1.4.2CD44免疫组化ABC法染色　　石蜡切片60℃烤片30min，依次入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、75%乙醇各10min，0.01MPBS漂洗,10min×2;15%H2O2室温处理30min，0.01MPBS漂洗，10min×2;切片置0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH6

6、.0)进行抗原微波修复15min，0.01MPBS漂洗10min×2;3%羊血清(0.3%TritonX100,0.01MPBS配制(PH7.3-7.4下同))37℃孵育30min，不洗;切片滴加一抗(CD44效价：1:250，3%TritonX100配制)37℃孵育2h，4℃过夜，0.01MPBS漂洗，10min×82;滴加相应入二抗(浓度1:200)37℃孵育1h，0.01MPBS漂洗，10min×2;滴加入三抗(浓度1:100)37℃孵育1h，0.01MPBS漂洗，10min×2;0.05%DAB显色3min

7、，0.01MPBS漂洗，10min×2;苏木素复染1min，1%盐酸酒精分色，1/600氨水蓝化;梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照以0.01MPBS替代一抗，其它步骤不变。　　1.5图象采集及数据分析　　本实验采用OLYMPUS数码照相机采集图象，应用图象分析系统(C.IMAGINGSYSTEMSUSA)进行骨小梁形态计量分析。免疫组化定量分析采用ImageProPlus图像分析系统，每张切片高倍镜(400×)下分析吸光度值，每张切片选取3个视野，每组动物选取5张切片，计算各组平均吸光度值。实验数据以

8、平均数±标准差表示，采用SPSS11.0统计软件进行t检验分析，以P<0.05为差异显著。　　2结果　　2.1去势12周后骨小梁退变情况　　去势后12周，OVX组大鼠椎骨骨小梁严重退变，骨小梁稀疏，断裂(图1)，骨小梁形态计量分析显示与对照组差异显著(表1)。表1去势12周大鼠椎骨骨小梁参数变化情况8　　2.2大鼠去势后骨髓