β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定

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1、β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定作者：邱文洪吴丽娜叶许楚娟易路阳郭凯文【摘要】目的：构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法：通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β半乳糖苷结合凝集素9基因，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果：DNA测序和酶切鉴定证明β半乳糖苷结合凝集素9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论：成功构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体pGal9。【关键词】Gal

2、9;构建;真核表达载体半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成员参与了许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等[1，2]。β半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白，属于半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成员，组织分布广泛，在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面，发挥着重要作用[3]。目前对Gal9发挥作用的具体机制仍知之甚少，值得进一步深入探讨和研究，从而使Gal89

3、作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此，本研究拟通过构建表达人Gal9蛋白的真核表达载体，为进一步研究Gal9的作用机制打下基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　T4连接酶、限制性内切酶(MBI)，Taq酶和RT试剂盒(Promega)，RNA提取试剂盒(Invitrogen)，质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen)，DNAmarker(Tiangen)，Trizol、1640培养基，人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Galectin

4、9引物(英骏生物技术有限公司)。　　1.2引物设计　　参照GenBank上Gal9(NM009587.2)序列设计引物如下:上游引物:P15'CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACAA3'，下游引物:P25'CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC3'，下划线分别为HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176bp。　　1.3分离人外周血单个核细胞8　　静脉取血，加入肝素溶液(10～50u/m1血样本)抗凝，用pH7.2Hanks液将抗凝血稀释1

5、倍;吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中，加入稀释的全血;2000r/min离心20min;吸取所有单个核细胞，用Hanks液洗涤细胞3次。将单个核细胞离心收集备用。　　1.4单个核细胞总RNA的制备、RTPCR及克隆入载体pcDNA3.1(+)　　将离心收集的单个核细胞1×105加入Trizol1mL，混匀，室温5min;加0.2mL氯仿，涡旋15s，4℃12000g，离心10min，吸取上清液至另一1.5mLEppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，放置10min，4℃12000g，离心10min，去上清液

6、，加入1mL预冷的浓度为750mL/L乙醇，充分混匀振荡，4℃12000g，离心10min，去上清液，充分干燥，用50μL含1mL/LDEPC的ddH2O溶解沉淀，获得细胞总RNA。取5μL总RNA，按RTPCR试剂盒推荐方法以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。取2μl逆转录产物为模板,加入10mMdNTP1.5ml,10′PCR缓冲液5m,l50mMMgSO41m,l两引物各10pmo,l补水至50m,lPCR反应条件为:95℃预变性5min，94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，反应

7、30个循环后，72℃延伸10min。取PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析。按照WizardPCR产物纯化试剂盒说明书纯化，回收PCR产物，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，定向插入表达载体pcDNA3.1(+)的相应位点。该质粒命名为pGal9，经PCR、Hind8Ⅲ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定序列的正确性。　　1.5统计学方法　　采用Prism4.0软件行单因素方差分析，以及组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1Gal9的RTPCR扩增　　从单个核细胞中提取细胞总RNA，以此为

8、模板，应用前述引物进行RTPCR，将扩增产物于10g/L琼脂糖电泳中，可见分布于Marker1.0～1.5kb的特异条带，与预计长度1176bp相符(图1)。　　2.2真核质粒pGal9构建和鉴定　　将RTPCR扩增产物，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)。阳性克隆送英骏公司测序，同时进一步对阳性重