“肝郁证”方证的代谢组学研究

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1、“肝郁证”方证的代谢组学研究作者：徐舒，陈合兵，李洪，张琪，蔡红兵，颜贤忠，吕志平【摘要】目的在肝郁证大鼠模型代谢组学研究基础上，进行逍遥散治疗肝郁证大鼠模型的方证代谢组学研究，探讨逍遥散治疗机制及进一步明确肝郁证的代谢组学特征。方法24只Wistar大鼠随机分为逍遥散+模型组、逍遥散+空白组、模型组、正常对照组，每组6只。逍遥散+模型组和模型组采用慢性束缚的方法造模，逍遥散+模型组和逍遥散+空白组同时用逍遥散灌胃，第22天采血检测血浆皮质酮，运用1HNMR技术对4组大鼠血清进行代谢组学分析。结

2、果模型组大鼠第15天，22天体质量增长缓慢，显著低于其它三组(P均<0.01);4组血浆皮质酮存在差异(P<0.001)，浓度从高到底依次为模型组、逍遥散+模型组、逍遥散+空白组和正常对照组，组间比较模型组显著高于逍遥散+模型组及其它两组(P<0.01)。代谢组学分析表明，4组样本间沿第1主成分(t1)方向有明显的分组差异，其中逍遥散+空白组与正常对照组之间稍有差异，而逍遥散+模型组与正常对照组样本的差别较大，模型组与正常对照组样本的差别最大，且物质的变化大多呈单向改变。结论逍

3、遥散对肝郁证的治疗作用在代谢物水平并非仅仅简单的上调、下调从而中和模型造成的代谢物变化，而可能是通过对机体的整体调节发挥治疗作用。通过方证整体研究，找出随证候模型和相应方剂治疗后变化一致并趋于正常的物质，可能较好地代表证候的代谢组学特征，从而更适合于中医证候研究。11【关键词】肝郁证;代谢组学;1H核磁共振;大鼠模型;方证研究　方证研究是中医证候研究的特色，以证选方，以方测证，方证之间紧密联系，有极强的客观性和科学性。将方证作为一个整体去研究，可以克服一般证候的模糊性和恒动转移性，更能有效地展示

4、证本质。通过观察某一证型在相应方药治疗前后临床症状的改善，不仅证实对原证候辨证的准确性，同时也说明所选方药是对“证”的;也就是通过“疗效”这个中心环节，同时证明“方”和“证”的科学性，这是由中医学理论理、法、方、药的一致性和整体观决定的;通过方证的整体研究从正反两个方向挖掘证的科学内涵，其同一性变化更能代表某一证特异性的变化。在成功建立“肝郁证”大鼠模型并对其进行代谢组学的初步研究基础上[1]，本课题组继而运用代谢组学方法对“肝郁证”的方证进行整体研究，以期进一步揭示肝郁证的科学本质。　　1材料

5、与方法　　1.1动物与材料实验用清洁级雄性Wistar大鼠24只，体质量(150±20)g，购自南方医科大学实验动物中心。适应性饲养1d后随机分为模型组、正常对照组、逍遥散+模型组和逍遥散+空白组共4组，每组各6只。正常对照组3只1笼，其余3组单笼孤养。恒定温度(21±3)℃，光-暗周期为1211h，动物自由摄食及饮水。逍遥散制剂：按《太平惠民和剂局方》原方比例调配(每剂中含柴胡12g，当归、白芍、白术、茯苓各10g，生姜6g，炙甘草3g，薄荷3g)，药物加10倍于药材量的水浸1h后，加热煮沸1

6、h，过滤后，再加水煮沸40min，于80℃恒温水浴中浓缩成含生药量1g/ml，存于-4℃冰箱备用。药材购于南方医院中药房，经中医药学院中药教研室鉴定为正品药材;中药煎液由南方医科大学中医药学院中药制剂教研室制备。　　1.2造模和干预参照严灿等[2]慢性束缚的方法，将模型组和逍遥散+模型组大鼠置于特制的束缚制动筒内，通过移动插片逐步缩小大鼠的活动空间，调节到其不产生强烈反抗的最小空间。每日开始时间随机，束缚制动1次/d，持续时间从第1天的4h逐渐增至6h/d，连续21d。模型组和逍遥散+模型组大鼠

7、在束缚制动期间禁食、禁水。逍遥散+模型组和逍遥散+空白组大鼠根据正常成人逍遥散每日用量，按体表面积换算成大鼠用药量为10g/(kg·d)，根据个体体质量每日上午8时给逍遥散+模型组和逍遥散+空白组大鼠经胃灌相应药量。　　1.3取材造模第21天4组大鼠均禁食不禁水，造模第22天各组大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射，打开腹腔由腹主动脉采血约8ml，抽取的血浆室温下静置2h，3000r/min离心共10min，取上游血清-40℃冰箱保存待检。11　　1.4行为学观察和血清皮质酮检测造模期间观察大鼠行为、

8、反应、排便、饮食等一般情况的变化，并在第8，15，22天称取体质量进行比较。大鼠皮质酮酶联免疫分析试剂盒购自USCNLIFE(CatalogNo.E0540r)，按说明书步骤检测4组大鼠血清皮质酮含量。所得数据以±s表示，用统计软件SPSS13.0分别进行重复测量方差分析和单因素方差分析，LSD组间比较，以α=0.05为显著性水准。　　1.5代谢组学检测分析运用1HNMR技术对4组大鼠血清进行驰豫编辑实验(CPMG)和扩散编辑实验(LED)核磁共振实验，分别观测血清中的小分子代谢物和脂类代谢产物