rhtnfα对tblcl趋化作用的研究

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1、rhTNFα对TBLCL趋化作用的研究作者：闵密克，马超武，徐建中，孙浩，金伯泉【摘要】目的研究重组人TNFα（recombinanthumantumornecrosisfactorα，rhTNFα）对扁桃体B原淋巴细胞（tonsilBlymphoblastoidcellline，TBLCL）的趋化作用，建立一个模型以研究细胞因子与B细胞相互间的作用。方法用EB病毒（EpsteinBarvirus，EBV）转化扁桃体B细胞建立TBLCL系，以小室法研究rhTNFα）对TBLCL

2、的趋化作用。结果rhTNFα对TBLCL有明显趋化作用，并呈剂量依赖关系。这种作用能为抗TNFα的单抗E6所阻断。结论以上为研究细胞与细胞因子间的相互作用提供了有用而简便的模型。【关键词】重组人TNFα；扁桃体B原淋巴细胞；趋化　　Abstract：ObjectiveToinvestigatedthechemoattractantofrhTNFαonTBLCL.MethodsLTCweretransfectedwithEBVtogettonsilBlymphoblasticcellli

3、ne(TBLCL).ResultsItwasfoundrhTNFαcanchemoattractsTBLCL,inaosedependntmannerandthischemiotacticeffectcanbeblockedbytheneurtralizingantobodyE6against13TNF.ConclusionThisisausefulmodelinstudytheinterferebetweenchemokineandimmunocyte.　　Keywords：recomb

4、inanthumantumornecrosisfactorα;tonsilBlymphoblastoidcellline;chemoattractantCorcione等[1]发现TNFα对人扁桃体初始B细胞以及记忆B细胞有趋化作用，还发现所有扁桃体B细胞均可以合成TNFα。因此他们认为TNFα以旁分泌与自分泌的形式参与调节B淋巴细胞在次级淋巴器官中的迁移。为了进一步的研究，需建立一个合适的模型。　　1材料和方法　　1．1材料　　可产生国际标准EBV毒株的B958细胞由第四军医大学免疫教

5、研室保存。rhTNFα由第四军医大学生物技术中心惠赠。二甲基亚砜（DMSO）购自FLUKA公司。鼠抗人HLADR，CD19mAb由第四军医大学免疫教研室制备。趋化小室底膜孔径为8μm，由日本仓敷纺绩株式会社出品。夹心法ELISA检测TNFα试剂盒由第四军医大学免疫教研室出品。13　　1．2方法　　1．2．1EBV的制备　　复苏B958细胞。用含20%FCS的RPMI1640完全培养基（Sigma公司），在37℃，5%CO2的孵箱中培养15d。离心，2500r/min，1min，上清以0．

6、45μm滤器过滤后冻存备用。　　1．2．2腭扁桃体细胞（palatinetonsilcell，PTC）的准备　　PTC单细胞悬液以前述方法制备，记数。离心，1000r/min，3min，弃上清。沉淀重悬于冻存液[含10%DMSO的FCS（V/V）]中，1×106/ml。置于-70℃冰箱，24h后移入液氮中。　　1．2．3TBLCL的制备　　复苏冻存的PTC，调整细胞数至5×105/ml。取1ml加入10ml离心管中，再加入等体积B958（EBV高产株）培养上清液，置于37℃，5%CO2的孵箱培

7、养。每周加含20%FCS的RPMI16400．5ml。3周后，移至25ml培养瓶中继续培养。4周后，可见增殖迅速、形态似母细胞样并相互聚合成团的TBLCL，即可扩大培养。13　　1．2．4间接免疫荧光染色和流式细胞术分析鉴定TBLCL　　用直头滴管，轻轻吹打TBLCL悬液，直至其成为单细胞悬液，调整细胞浓度至5×106/ml，各取40μl细胞悬液，分别加入有HLADR，CD19，CD3和SEB单抗的离心管中，再加入1：20灭活的正常山羊血清。4℃，静置30min，洗涤液洗涤2次，1000

8、r/min，5min。弃上清，加入50μl1:100稀释的，FITC标记的兔抗鼠IgGF（ab'）2段，摇匀，4℃静置30min。洗涤两次后加入200μl固定液，流式细胞仪检测TBLCL上各类分子的表达情况。　　1．2．5rhTNFα对LCL的趋化作用　　将不同浓度的rhTNFα（比活性106U/mg）分别加入24孔板，400μl/孔。调整TBLCL至1×106/ml，取200μl加入趋化小室。将小室置于24孔板中，37℃，5%CO2孵育。实验终止时在24孔板中加入EDTA