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《rhTNFα对TBLCL趋化作用探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、rhTNFa对TBLCL趋化作用探究作者：闵密克，马超武，徐建中，孙浩，金伯泉【摘要】目的研究重组人TNFa(recombinanthumantumornecrosisfactora,rhTNFa)对扁桃体B原淋巴细胞(tons订Blymphoblastoidcellline,TBLCL)的趋化作用，建立一个模型以研究细胞因子与B细胞相互间的作用。方法用EB病毒(EpsteinBarv让us，EBV)转化扁桃体B细胞建立TBLCL系，以小室法研究rhTNFa)对TBLCL的趋化作用。结果rhTNFa对TBLCL有明显趋化作用，并呈剂量依赖关系。这种作用能为抗TNFa的单抗E6所阻
2、断。结论以上为研究细胞与细胞因子间的相互作用提供了有用而简便的模型。【关键词】重组人TNFa；扁桃体B原淋巴细胞；趋化Abstract:ObjectiveToinvestigatedthechemoattractantofrhTNFaonTBLCL・MethodsLTCweretransfectedwithEBVtogettonsilBlymphoblasticcellline(TBLCL).ResultsItwasfoundrhTNFacanchemoattractsTBLCL,inaosedependntHiannerandthischemiotacticeffectcanb
3、eblockedbytheneurtralizingantobodyE6againstTNF.ConclusionThisisausefulmodelinstudytheinterferebetweenchemokineandimmunocyte・Keywords:recombinanthumantumornecrosisfactora；tonsilBlymphoblastoidcellline；chemoattractantCorcione等［1］发现TNFa对人扁桃体初始B细胞以及记忆B细胞有趋化作用，还发现所有扁桃体B细胞均可以合成TNFao因此他们认为TNFa以旁分泌与自
4、分泌的形式参与调节B淋巴细胞在次级淋巴器官中的迁移。为了进一步的研究，需建立一个合适的模型。1材料和方法1.1材料可产生国际标准EBV毒株的B958细胞由第四军医大学免疫教研室保存。rhTNFa由第四军医大学生物技术中心惠赠。二甲基亚枫（DMSO）购自FLUKA公司。鼠抗人HLADR,CD19mAb由第四军医大学免疫教研室制备。趋化小室底膜孔径为8Um,由日本仓敷纺绩株式会社出品。夹心法ELISA检测TNFa试剂盒由第四军医大学免疫教研室出品。1.2方法1.2.1EBV的制备复苏B958细胞。用含20%FCS的RPMI1640完全培养基(Sigma公司)，在37°C,5%CO2的
5、孵箱中培养15d。离心，2500r/min,1min,上清以0・45um滤器过滤后冻存备用。1.2.2腭扁桃体细胞(palatinetonsilcell,PTC)的准备PTC单细胞悬液以前述方法制备，记数。离心，1000r/min,3min,弃上清。沉淀重悬于冻存液［含10%DMS0的FCS(V/V)］中，lX106/ml。置于-70°C冰箱，24h后移入液氮中。1・2・3TBLCL的制备复苏冻存的PTC,调整细胞数至5X105/mlo取1nd加入10ml离心管中，再加入等体积B958(EBV髙产株)培养上清液，置于37°C,5%C02的孵箱培养。每周加含20%FCS的RPMI1
6、6400.5mlo3周后，移至25ml培养瓶中继续培养。4周后，可见增殖迅速、形态似母细胞样并相互聚合成团的TBLCL,即可扩大培养。1.2.4间接免疫荧光染色和流式细胞术分析鉴定TBLCL用直头滴管，轻轻吹打TBLCL悬液，直至其成为单细胞悬液，调整细胞浓度至5X106/ml,各取40u1细胞悬液，分别加入有HLADR,CD19,CD3和SEB单抗的离心管中，再加入1：20灭活的正常山羊血清。41,静置30min,洗涤液洗涤2次，1000r/min,5min。弃上清，加入50H11:100稀释的，FITC标记的兔抗鼠IgGF(ab?)2段，摇匀，4°C静置30mine洗涤两次后
7、加入200n1固定液，流式细胞仪检测TBLCL±各类分子的表达情况。1.2.5rhTNFa对LCL的趋化作用将不同浓度的rhTNFa(比活性106U/mg)分别加入24孔板，400卩1/孔。调整TBLCL至lX106/ml,取200U1加入趋化小室。将小室置于24孔板中，37°C,5%CO2孵育。实验终止时在24孔板中加入EDTA,终浓度为5mmol,继续孵育15mine人工记数24孔板中的TBLCL浓度。1・2.6夹心ELISA法检测小室内外rhTNFa浓度的变化留取不同时间点
