rhepo对局灶性脑缺血再灌注脑损伤保护机制的研究

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1、rhEPO对局灶性脑缺血再灌注脑损伤保护机制的研究作者：周铁柱王薇胡晓颖陈雪【摘要】　　目的观察rhEPO对缺血性卒中脑海马区不同时间点S100B蛋白表达的动态变化，研究rhEPO对局灶性脑缺血再灌注损伤影响的可能机制。方法取66只SD大鼠建立局灶性脑缺血再灌注（I/R）模型，随机分成假手术对照组（n=6）、脑I/R组（n=30）、rhEPO治疗组（n=30），按再灌注时间分为5个亚组，每个亚组6只（6h组、12h组、1d组、3d组、7d组），缺血2h后开始再灌注。免疫组化法检测缺血不同时间各组脑海马缺血中心和周围区S100B蛋白，原位末端标

2、记技术检测各组脑海马缺血中心和周围区神经细胞凋亡。结果脑I/R损伤组与假手术对照组比较细胞凋亡数明显增多（P＜0.05），rhEPO治疗组与脑I/R组相比，凋亡细胞数明显减少（P<0.05）；免疫组化检测结果显示，I/R组与假手术对照组相比，S100B蛋白表达明显增加（P<0.05)，rhEPO治疗组与脑I/R组相比，S100B蛋白表达明显减少（P<0.05)。结论rhEPO可能通过减少S100B蛋白表达、抗凋亡对局灶性脑缺血I/R产生保护作用。【关键词】EPO；脑缺血；再灌注脑损伤；凋亡7　　近来研究发现，重组人红细胞生成

3、素（rhEPO）对脑缺血再灌注损伤(I/R)具有神经保护作用〔1〕，S100B蛋白是神经胶质细胞分泌的蛋白质，是反映神经细胞损伤的标记物，目前国内外缺少给予rhEPO后脑缺血灌注区S100B蛋白动态观察的相关报道。为进一步探讨rhEPO对缺血性脑损伤产生保护作用的机制，本文观察了大鼠局灶性脑缺血再灌注后腹腔内注射rhEPO后大鼠海马区S100B蛋白表达的影响。　　1材料与方法　　1.1材料　　健康Wistar大鼠66只，雄性，体重250～280g，中国医科大学实验动物中心提供。10%水合氯醛、SABC试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒、DAB显

4、色剂（武汉博士德）；rhEPO(沈阳三生制药股份有限公司)；抗S100B抗体、尼龙线直径2.3mm（日本伊东公司）；Olympus实体显微镜、计算机图像分析软件（MetamorphImagingSystem）(中国医科大学实验技术中心)。　　1.2方法　　1.2.1动物模型制备及分组7　　采用ZeaLonga〔1〕的大脑中动脉线栓法并加以改进，制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型。大鼠用1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，动物仰卧位固定于手术台上，颈正中切口，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），

5、结扎ECA及CCA，在CCA分叉处剪一切口，将尼龙线栓子经CCA和ICA进入到大脑中动脉起始部，阻断右侧大脑中动脉，尼龙线栓子插入的深度距ICA和ECA分叉处为（20±0.5）mm，扎紧ICA处的备用线。假手术对照组除不插入栓子外其余同实验组，手术中和手术后维持动物体温在37℃左右，缺血2h后，拔出栓子2mm，使血液再灌注，成功后假手术对照组及缺血组分别腹腔内注入0.3ml生理盐水，治疗组腹腔内注入rhEPO(4000U/kg)0.3ml（1000U），按不同缺血时间断头,取脑组织。该模型成功的标志：右侧Horner征，左侧出现以前肢为重的偏

6、瘫。实验分3组：假手术对照组6只；I/R组及rhEPO治疗组，每组30只，均为脑缺血2h再灌注6、12h、1、3、7d处死，每个时间点6只。　　1.2.2免疫组化染色检查　　各组大鼠至指定时间点处死后断头取脑，取前囟前后1mm脑组织，常规固定、石蜡包埋、每隔100μm连续冠状切片（厚6μm），进行免疫组化染色检测S100B蛋白的表达情况。显微镜下观察海马细胞胞浆有棕褐色颗粒者为阳性细胞。7　　1.2.3TUNEL原位凋亡染色法检测细胞凋亡　　按照原位TUNEL试剂盒说明书对各组大鼠脑组织切片进行凋亡染色，细胞核中出现棕褐色颗粒者为阳性细胞。　

7、　1.3统计学处理　　每张切片中采集海马4个高倍视野，其中每个视野中细胞总数不少于100个。所测数据以x±s表示，组间比较采用SPSS13.0软件进行t检验。　　2结果　　2.1各组S100B蛋白表达　　脑I/R损伤组与假手术对照组相比，S100B蛋白表达明显增加（P<0.05)，rhEPO组较脑I/R组S100B蛋白表达明显减少（P＜0.05），见表1、图1。表1不同脑I/R时间点各组大鼠海马S100B蛋白表达（略）　　2.2神经细胞凋亡情况7　　脑I/R组与假手术对照组比较神经细胞凋亡数明显增多（P＜0.05），rhEPO组较缺血再

8、灌注损伤组比较神经细胞凋亡数明显减少（P＜0.05），见表2、图2。表2不同脑I/R时间点各组海马细胞凋亡数（略）　　3讨论红细胞生成素(erythropoieti