d半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究

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1、D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究作者：魏晓东刘玉萍李晶孙洁欧芹【摘要】目的研究D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化作用及菟丝子醇提液对其影响，探讨衰老发生的机制及菟丝子延缓衰老作用的机制。方法采用D半乳糖制作衰老大鼠模型，观察15、30、45d时的糖化血红蛋白(GHb)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)活性的变化。采用半定量RTPCR法测定大鼠胸主动脉糖化终末产物受体(RAGE)mRNA的表达，并观察菟丝子醇提液对其影响。结果D半乳糖导致GHb、MDA和RAGEmRNA水平升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.

2、01)，并呈现时间渐进性改变。菟丝子醇提液使大鼠GHb、MDA降低(P<0.01)，SOD活性增加(P<0.01)，RAGEmRNA表达水平降低(P<0.01)。结论D半乳糖诱导非酶糖基化发生，菟丝子醇提液抑制D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化反应，在给药30d即有显著的作用效果。【关键词】菟丝子;非酶糖基化;衰老;D半乳糖;大鼠8衰老的非酶糖基化理论认为糖基化造成的蛋白质的交联损伤是衰老的主要原因〔1，2〕，其反应在正常机体即缓慢进行，生物大分子无需酶的参加即可与氨基酸或核酸的氨基反应最终形成糖基化晚期终产物(AGE)〔3〕。研究表明随衰老在多种组

3、织中出现AGE的增多，说明AGE在衰老及衰老相关疾病的发生机制中起一定的作用〔4～6〕，有些学者认为AGE可以作为衰老的生物学特征〔7〕。菟丝子常用作补益中药，药理学研究表明其具有补肾壮阳、提高机体免疫能力、调节内分泌、抗氧化等作用〔8～11〕。但关于菟丝子醇提液对衰老过程中AGE的影响及其作用机制国内外尚未见报道。本研究从衰老的非酶糖基化出发说明非酶糖基化与自由基代谢的关系及菟丝子对其作用，以进一步明确衰老的发生机制和菟丝子抗衰老作用的机制。　　1材料与方法　　1.1药品及实验动物选用Wistar雄性大鼠67只，体重180～220g，由佳木斯大学动物实验中心提供(黑

4、动字第99102001)。菟丝子购自佳木斯华伟大药房，由本校生药教研室鉴定。菟丝子以8倍乙醇回流提取，旋转蒸发器回收乙醇，余液浓缩至含6g生药/ml，盐酸镁粉实验鉴定菟丝子醇提液中所含成分。　　1.2动物分组及处理将67只大鼠随机分为青年组10只，衰老模型组27只，其中15、30和45d组各9只;模型给药组30只，又分为给药15、30和45d组每天各10只;各组正常饮食，衰老模型组每日上午按48mg/kg体重颈背部皮下注射D半乳糖，按0.5ml/100g体重灌服温开水;模型给药组除按模型组注射D8半乳糖外，每日按0.5ml提取液/100g体重灌服菟丝子醇提液，各

5、组眼球取全血，并行颈椎离断，取样液氮保存备用。　　1.3指标的测定红细胞SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法;全血MDA含量和糖化血红蛋白(GHb)测定采用TBA比色法，测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠胸主动脉AGE受体(RAGE)表达水平测定：取胸主动脉100mg液氮中迅速研磨成匀浆，转入装有1ml预冷Trizol的EP管中，室温静置15min，加入0.2ml氯仿，震荡30s，冰上静置10min后12000r/min,离心15min，取上清液置另一管中，加等体积冷异丙醇，静置10min，12000r/min离心10min，弃上清，用70%乙醇洗2次后，4℃1

6、2000r/min，离心5min，弃上清，真空离心干燥5～10min，沉淀用水溶解。RNA样品处理：37%甲醛3.5μl，10×MOPS2μl，RNA样品溶液4.5μl，甲酰胺10μl，混匀，68℃温育15min，冰浴15min，加入10×上样缓冲液2μl混匀。采用电泳凝胶成像系统观察RNA分离情况和28SrRNA与18SrRNA的情况。采用DU800核酸蛋白检测仪测定RNA纯度。RTPCR法合成RAGEDNA：cDNA反应体系：引物选择OligodT18AdaptorPrimer按程序操作，5×RNAPCR缓冲液5μl，无RNA酶H2O6.5μl，dNTP混合

7、物4μl，RNA酶抑制剂0.5μl，AMV逆转录酶1μl，OligodT上样引物1μl，RNA样品2μl，混匀，移入PCR仪，42℃60min;95℃5min;1循环。PCR反应：采用βactin作内参，引物5′GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′,5′8GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′(扩增产物513bp);RAGE引物5′ATGAGCAGAGCGGCTATTCC3′，5′CACGCTTCGGTCAGAGCTCA3′(扩增产物530bp)。94℃5min，1循环，94℃40s，54℃40s，72℃80