课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (3)

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1、微生物的培养与应用课题2:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题目标研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。二、课题重点与难点重点：对土样的选取和选择培养基的配制。难点：对分解尿素的细菌的计数。三、研究思路微生物的选择培养，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术，也称为微生物的“选择培养”。（一）筛选菌株在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的惟一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其

2、他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。（二）统计菌落数目统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。思考题1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌

3、落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。（三）设置对照究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。另一种方案：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。实验方案有两种一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问

4、题。四、实验案例实验的具体操作步骤如下:1.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。土壤中某样品细菌的分离与计数准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基

5、，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。2.制备培养基将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250mL），充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。3.微生物的培养与观察将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比

6、较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时

7、还应当有针对性地提供选择培养的条件。思考题4.细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手

8、段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。五、操作提示无菌操作做好标记规划时间六、课题成果与评价（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，