蛋白质及氨基酸的测定

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1、蛋白质及氨基酸的测定生物技术第三组蛋白质存在于一切生物的原生质中，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生命的物质基础。凡是有生命的物体，无论是动植物还是微生物，都还有蛋白质。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转和遗传等密切相关，缺乏蛋白质生物就不能维持生命。人及动物只能从食物中得到蛋白质及其分解代谢产物来构成自身蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。蛋白质是由多种氨基酸结合而成的复杂的高分子化合物。其中含有的主要化学元素为碳、氢、氧、氮等，大多数蛋白质还含有硫，某些蛋白质中还含有微量的磷、铜、铁、碘、锌等元素，但含氮则是蛋白质区分其他有机

2、化合物的主要标志。测定食物中蛋白质含量的方法有多种，一般可分为间接方法和直接方法。间接方法是通过测定样品中蛋白质的总氮量，再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量直接方法是根据蛋白质的物理和化学性质，直接测定蛋白质含量的方法。测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，应用广泛。此外，双缩脲法、紫外吸收法、考马斯亮蓝G-250法、福林-酚法等也常用于蛋白质含量测定。蛋白质的测定方法：凯氏定氮法双缩脲法紫外分光光度法福林-酚比色法考马斯亮蓝染料比色法由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定总有机氮最准确和操

3、作简单的方法之一。适用范围：此法只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量，由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物，因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法常量凯氏定氮法微量凯氏定氮法半微量凯氏定氮法自动定氮仪法常量凯氏定氮法适用范围：适用于各类食品中蛋白质含量的测定，也是测定蛋白质含量的国家标准分析方法。一原理：有机含氮化合物与浓硫酸和催化剂共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。A.样品消化浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还原作用，使有机

4、物碳化的同时在高温下又有强氧化性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。B.蒸馏在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热蒸馏，生成气态氨。C.吸收用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。D.滴定标准盐酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液为了加速反应进行，我们常需加入一定量加速剂。按其效果不同可分为：增温剂、催化剂和氧化剂。1.增温剂当温度低于360°C时，消化不完全，尤其是杂环氮化物，会导致分析结果偏低。当温度高于410°C时，铵盐就会分解，故消化温度最好控制在二者之间。纯硫酸的沸点是340°C附近，因其温度达不到最适，则需要添加增温剂，常用的增温剂有：

5、硫酸钾，硫酸钠，主要原因是消化过程中硫酸不断被分解，水分不断逸出使硫酸浓度增大。注意：加入量不能过大，温度过高会引起已生成的铵盐分解释放出氨而造成损失。2.催化剂其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。3.氧化剂由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。常用的有：高氯酸，过氧化氢仪器A、凯氏烧瓶规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml特点：瓶颈长、耐高温B、常量凯氏定氮装置1、浓硫酸2、硫酸铜3、硫酸钾4、4%硼酸溶液5、甲基红

6、---溴甲酚绿混合指示剂：五份0.2%溴甲酚绿、95%乙醇溶液、一份0.2%甲基红乙醇溶液均匀混合6、40%NaOH溶液7、0.1000mol/L盐酸标准溶液试剂测定一、消化：1、称量：准确称取固体样品1.00~3.00g（视样品含氮量多少而定）或吸取液体样品10.0~20.0mL2、试剂混合：小心将样品移入洁净的500mL凯氏烧瓶中，加入0.50g硫酸铜、10.0g硫酸钾、20mL浓硫酸（小心），轻摇匀，安装消化装置，在凯氏烧瓶口放一漏斗，并将其倾斜放置于放有石棉网的电炉上。3、消化：先小火慢慢加热（尽量减少气泡，防止泡沫冲到瓶颈而造成氮损失），待内容物全部碳化、泡沫消失，升高温度

7、（保持瓶内液体沸腾）至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。4、冷却：冷却至室温，小心加入200mL蒸馏水，再加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。二、蒸馏1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL40g/L硼酸溶液及指示剂2~3滴）2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液，并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸