实验三 红细胞计数、血红蛋白测定及白细胞分类计数--上课用

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1、红细胞计数、血红蛋白测定及白细胞分类计数红细胞计数（一）原理用等渗稀释液将血液稀释并充入计数池后，于显微镜下计数。（二）试剂与器材Hayem液（氯化高汞、氯化钠、结晶硫酸钠）血细胞计数板（三）操作2ml稀释液+10ul血液，洗涤，振荡，混匀，充池，高倍镜计数中央大方格周围四个及中央五个中方格内细胞总数。（四）计算细胞数/5×25×10×200×106=细胞数/100×1012/L（五）质量保证1.取血部位不当;2.稀释倍数不准3.血液凝固;4.混合不均匀，充液不当5.白细胞的影响6.血浆自身凝集素或球蛋白过高，红细胞易聚集。（六）临床

2、意义1、增多（1）相对性增多（2）绝对性增多（3）真性红细胞增多症2、减少（1）造血物质减少（2）红细胞破坏过多（3）红细胞丢失过多（4）骨髓造血功能衰竭3、红细胞计数和血红蛋白测定的关系二、血红蛋白测定（HiCN法）（一）原理血细胞经血红蛋白转化液溶血后，除SHb外，其他血红蛋白均被高铁氰化钾氧化成Hi，与CN—结合生成稳定的氰化高铁血红蛋白。它的最大吸收峰在540nm，测定A，得血红蛋白浓度。（二）试剂、器材文齐氏液、721分光光度计（三）操作5ml血红蛋白转化液+20ul血液，振荡，混匀，5min后721分光光度计上测定。波长5

3、40nm。转化液调零，1cm比色杯。（四）结果报告1.A/44/1×64458/1000×251=A×367.7（g/L）2..标准曲线法测定参考标准品的A值，以Hb浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制通过零点的曲线，查表。3.K值法:K=Hb总和/A值总和Hb浓度=A×K（五）质量保证1.丙球蛋白异常，白细胞异常增多，SHb疾病时，测定液体发生浑浊，可增加NaCl，消除影响。2.废液的处理每升加次氯酸钠35ml，敞开过夜。CN-氧化成CO2和N2，或水解CO32-和NH4+。3、对分光光度计相关参数的校正。（六）方法学评价该方法结果稳定

4、可靠，操作简便，为标准方法，但有一定毒性。除了该方法外，还有SDS-Hb法和沙利氏法等，但SDS本身质量差异大，摩尔消光系数、标准液有待研究，为次选方法。沙利氏法误差大，已经被基本淘汰。血涂片制备、白细胞分类计数血涂片制备实验原理：使用推片将血液在载玻片上制成血膜。实验步骤：1、采血：直接用洁净的玻片蘸一滴血（使用毛细血管采血的方法）。2、推片：左手平置载玻片，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿推片的边缘展开适当的宽度，立即将推片与载玻片呈30-45度角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适当的血涂片，血涂片应呈舌状，头、体、尾清晰可

5、见。3、干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。4、标记：在载玻片的一端用记号笔编号。血涂片制备注意事项：1、要制备良好的血涂片，玻片必须干净。2、最好使用非抗凝血制备，也可以EDTA抗凝血制备。3、血膜应厚薄适当，头尾及两侧应有一定的空隙。4、血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。5、蘸在玻片上的血液量要适度，过多或过少均会影响涂片的结果。血涂片染色实验原理：不同种类的细胞及细胞的不同成分对酸性或碱性染料的亲和力不同，因而瑞氏染色后各种血细胞显示出各自的染色特征。实验步骤：1

6、、待血涂片干燥后，用蜡笔在两端划线，以防染色时染液外溢。将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其迅速盖满血涂片，约0.5-1min后，滴加等量的或稍多的缓冲液，用吸耳球对准血片吹气，使染液充分混合。2、冲洗：室温染色5-10min后用流水冲去染液，待干。3、观察结果：将干燥后的血片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体尾交界处血细胞平铺的部分。血涂片染色注意事项：1、未干透的血膜不能染色，否则细胞容易脱落。2、染液的量应适度，过少易挥发沉淀。3、染色时间的长短与染液浓度、染色时温度及血细胞的多少有关。4、冲洗时不能先倒掉染液，应以流

7、水冲洗以防染料沉着在血涂片上。5、染色过淡，可以复染，复染时应先加缓冲液，创造良好环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液而不能先加染液。6、血细胞中的各种有机物质特别是蛋白质对染色环境中氢离子浓度十分敏感。染色环境偏酸，增强伊红着色，红细胞和嗜酸粒细胞偏红，细胞核呈淡蓝或不着色，染色环境偏碱，增强天青着色，所有细胞呈灰蓝色，颗粒深蓝。白细胞分类计数实验原理：血细胞经涂片、固定和染色后，根据不同的形态和染色特征可将各种白细胞区分开来，计数一定数量的白细胞并进行分类、汇总，可计算出各种白细胞所占的百分比。实验步骤：1、血涂片的制备与染

8、色。2、镜检：使用低倍镜浏览全片，观察细胞的着色、分布情况。高倍镜检查有无异常或外来细胞。最后选择血涂片体尾交界处染色良好、分布均匀的区域，滴香柏油一滴，在油镜下按一定顺序对视野中所见的白细胞进行分类。要避免重复计数或漏