e蛋白检测技术在宫颈癌早期筛查中的应用

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1、E7蛋白检测技术在宫颈癌早期筛查中的应用前言宫颈癌是中国女性第二大最常见的恶性肿瘤，也是发展中国家女性癌症死亡的主要原因。我国每年新增宫颈癌病人13万多，每年约有5万人死于宫颈癌，且发病年龄明显趋于年轻化，35岁以下的宫颈癌病例出现上升趋势，严重危害妇女健康，因此宫颈癌的筛查和预防具有重要意义。宫颈癌的发展一般需要10年左右时间，在这期间，若能及早发现癌前病变，就可以有效预防癌症的发生。《2015年美国癌症筛查指南》推荐：1）21-29岁女性，应单独进行宫颈细胞学检查，每3年1次；2）30-65岁女性，优先推荐细胞学和HPV联合

2、筛查，每5年1次,也可每3年1次细胞学筛查；3）对于前10年内细胞学检测连续3次阴性或细胞学和HPV联合筛查连续2次阴性且最后一次筛查在5年内的女性，65岁后应停止任何方式的筛查；4）任何年龄段都不需要通过任何方式每年筛查。目前临床常用的宫颈癌筛查方法包括：传统的巴氏细胞学检测、液基薄层细胞涂片、HPVDNA分子检测等。近年来，宫颈癌筛查出现了一系列新技术包括：HPVmRNA检测、“替代性生物标志物”（surrogatemarker）检测等。E7癌蛋白的表达和功能是宫颈癌发生和发展的重要条件大量研究发现，人乳头瘤病毒（Human

3、papillomaviruses，HPV）与宫颈癌发生发展关系密切，是所有宫颈鳞状细胞癌（SCC）和大部分宫颈腺癌的致癌病原体。目前已经有200多种的HPV亚型被鉴定[1]，根据其致癌性分为高危型HPV（hrHPV）和低危型HPV（lrHPV），其中14种主要高危型HPV与宫颈癌的发生和演变有关。虽然HPV感染的人群比例很大，但HPV感染不等于宫颈癌，一过性的阳性携带者中80%以上在6到12个月内会自然清除，只有很少一部分会进展到宫颈病变或癌症。持续性的hrHPV感染，使病毒基因得以整合到人体细胞基因组内，启动病毒致癌基因E6，

4、E7蛋白表达。E6，E7蛋白被证明是驱动宫颈癌发展的主要致癌因子[2,3]。高表达的E7蛋白与Rb结合使Rb-E2F复合物解离，E2F从pRb蛋白中释放，Rb通路失控，反馈刺激p16INK4A、Ki67、细胞周期蛋白A（CyclinA）和细胞周期蛋白E（CyclinE）等在内的众多细胞增殖相关基因的表达，使宫颈上皮细胞的细胞周期发生紊乱。因此，“E7蛋白表达是维持宫颈癌及其高级别癌前病变发展必需的。”——E7蛋白表达与宫颈癌发展存在因果关系。细胞学诊断技术进展自Papanicolaou发明巴氏涂片法以来，巴氏涂片细胞学检查作为宫

5、颈癌的筛查方法已有70多年的历史，作为第一代细胞学检测技术巴氏图片的假阴性率在50%以上；而本世纪初以液基细胞学（liquidbasedcytology）为代表的第二代细胞学检测技术改善了样本的制片质量，但检测灵敏度在50~70%之间仍不能满足临床需求；以免疫细胞学（immuno-cytology）为代表的第三代细胞学检测技术，代表性产品为罗氏的CINtecPLUS（p16INK4A/Ki67双染），据PALMS研究报道，p16INK4A/Ki67的灵敏度能够达到85%以上[4]。这些替代性的蛋白标志物在正常宫颈细胞中也有内源性

6、表达，由此影响了它们在宫颈癌诊断方面的应用。而仅在高危型HPV转化的宫颈癌细胞中表达的E7癌蛋白无疑是宫颈癌早期诊断的理想标志物[5]。1514345468829037576.jpg图1细胞学诊断技术发展三阶段E7蛋白标志物在细胞学上的应用E7-ICC是针对宫颈上皮脱落细胞中来自于HPV基因编码的E7癌蛋白表达的临床检测新方法，通过使用E7单克隆抗体，能够特异性识别表达E7蛋白的癌变细胞（试验操作过程如图2所示）。检测结果在细胞样本中出现明显的棕色胞质染色，即可认为该细胞为E7-ICC阳性染色。（临床实验室2016年第9期）。1

7、514345499594036889.jpg图2E7-ICC技术试验程序采用的液基细胞学制片技术评估E7-ICC技术的临床应用。图3中阳性对照采用高级别鳞状上皮内病变（HSIL）的临床样本，阴性对照为未见上皮内病变（NILM）的正常宫颈上皮细胞临床样本。结果如图所示：在表达E7蛋白的转化细胞中呈现棕色染色，且定位于形态学为HSIL的细胞中（图3A，C）；而在NILM的样本中未检测到E7单抗的染色。值得注意的是，E7癌蛋白是否表达可以用来评估LBC报告（如HSIL，LSIL和ASC-US等）中不同级别宫颈损伤程度的恶变倾向，证明了

8、使用特定的生物标志物解释细胞学结果的可行性。这对于细胞形态学某些不确定病例的分流是非常有必要的，例如ASC-US。如图3E所示：该病例传统细胞学报告为ASC-US，在癌前病变细胞中检测除了E7癌蛋白的表达。另外，E7-ICC检测技术与目前市场上绝大部分的国产（安