功能化离子液体修饰猪胰脂肪酶的研究

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1、精选公文范文管理资料功能化离子液体修饰猪胰脂肪酶的研究　　脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)主要是指一类能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的酶，广泛应用于水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前用途最广泛的酶催化剂之一。猪胰脂肪酶(porcinepancreaslipase，PPL)是一类重要的脂肪酶，在食品、化妆品、医药、洗涤剂和畜牧业等领域中均有广泛应用。然而，PPL的应用仍然存在一些不足，如一般具有实际应用价值的

2、目标化合物并不是它的天然底物;PPL活力不高，在有机溶剂、高温、极端pH等非天然环境下极易失活等，这些不利因素限制了PPL在工业上进一步的广泛应用。因此，对PPL[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料进行分子改性以强化其催化性能，为工业应用提供活性更高、稳定性更好、环境耐受性更强的新酶品种，具有重要的实际应用价值。　　化学修饰具有廉价、周期短、实验室可行、容易创造新型的酶学性质等优点，是对脂肪酶进行分子改性的一种重要手段。虽然化学修饰PPL已经取得了一定的研究进展，但仍然局限于脂肪

3、酸、氨基酸、酸酐、聚乙二醇(PEG)和多糖等常用修饰剂的研究，修饰酶的催化活性、稳定性、耐有机溶剂性等性能往往不能同时得到有效的改善以满足反应的需要。　　离子液体近年来在生物催化领域的应用越来越广泛，脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、醇氰酶、氧化还原酶等多种酶都在离子液体中显示出了很好的稳定性。在离子液体中酶催化的区域、对映体选择性往往都有所增加，尤其作为高极性底物的酶催化反应介质，离子液体显示出了巨大的潜力。笔者所在课题组将功能化离子液体作为酶固定化载体材料SBA-15的表面修饰剂，结果表明修饰载体固定化的

4、酶对温度、pH等的稳定性得到了有效提升，而且相对活力较游离酶有了较大提高。在固定化方法中，离子液体作为载体修饰剂。近几年，Bekhonche[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料等首次提出了离子液体修饰酶的新型化学修饰方法，用含羟基的咪唑、吡咯等离子液体修饰甲酸脱氢酶，修饰酶的活性和稳定性得到了显着提升。这些研究说明离子液体不仅可以作为反应介质用于酶催化反应中，还可以分别用作固定化载体及酶分子自身的修饰剂，目前还没有其他用功能化离子液体修饰脂肪酶的报道。本文以PPL为例，希望发展一

5、种酶分子改造的新方法。　　1材料与方法　　1.1药品与试剂　　PPL购自Sigma公司并在0～4℃下保存，酶的蛋白质含量为9.3%，以三乙酸甘油酯为底物时比酶活力为362U/g(45℃、pH7.5)。3种离子液体氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑(99%)、氯化1-羧甲基-3-乙基咪唑(99%)、氯化1-羧甲基-3-丁基咪唑(99%)购自上海成捷化学有限公司。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(98%)、N-羟基琥珀酰亚胺(98%)、吗啉乙磺酸(97%)[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范

6、文管理资料购自阿拉丁试剂公司。其余试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。　　1.2离子液体的活化　　取0.001mol的离子液体，加入0.0012mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺及0.1115molN-羟基琥珀酰亚胺，在5mL的吗啉乙磺酸溶液中，室温搅拌反应2h后停止。　　1.3活化的离子液体修饰PPL　　取2gPPL用去离子水溶解，向酶溶液中缓慢加入活化的离子液体，在0～4℃下，磁力搅拌6h后，在去离子水中透析24h备用。修饰度的测量通过三硝基苯磺酸法才测定。　　1.4蛋白质

7、含量测定　　按照Bradford的方法，以牛血清蛋白作为标准蛋白质绘制标准曲线。测定酶液的吸光值，根据标准曲线计算蛋白浓度。　　1.5酶活的测定　　1)三乙酸甘油酯乳化液的制备将6.83g三乙酸甘油酯在强力搅动下缓慢加入磷酸缓冲液(pH7.0)，得到三乙酸甘油酯乳化液，再加入磷酸盐缓冲液定容至100mL。　　2)酶活测定取10mL[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料上述制备的三乙酸甘油酯乳化液于100mL锥形瓶中，再加入15mL磷酸盐缓冲液(pH7.5)，于50℃、150r/mi

8、n下预热5min，然后向其中加入酶开始反应。反应10min后取出，立即加入15mL乙醇终止反应。用0.025mol/L的NaOH溶液滴定，记录NaOH的消耗量。　　在一定条件下，每分钟酶催化三乙酸甘油酯生成1μmol乙酸所需要的酶量，定义为一个酶活单位(U)。　　1.6最适温度及最适pH的检测　　1)最适温度调节反应缓冲液pH为7.0，分别在30、35、40、45、50、55、60和65℃下水浴反应10min，取出测定酶活。　　2)最适pH调节反应液的pH分别为6.0