荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶

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4、国家级医学科技期刊征稿【摘要】 　　合成了一种新的底物水杨酸磷酸酯(SP)，用于荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶(ALP)活力。在37.0℃的TrisHCl缓冲液

5、(pH9.0)条件下,碱性磷酸酶作用于荧光底物SP，水解生成强荧光产物水杨酸(SA)，生成的SA的量与参与反应的ALP的活力成正比。据此建立了荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶活力的新方法。测定碱性磷酸酶的线性范围是0.03～6.00U/L，检测限为7.04mU/L。本方法适用于血清中碱性磷酸酶的测定。测定结果与临床上常用的以对硝基苯磷酸酯为底物的分光光度法相比，无显著性差异。【关键词】 碱性磷酸酶荧光光度法水杨酸磷酸酯　　1 引言   　　碱性磷酸酶(ALP,EC3.1.3.1)的活性测定是临床上最常见的测定项目之一[1]。血液中的ALP主要来自于肝脏和骨骼，因此在这

6、些器官发生病变时血清ALP活力会明显增高。ALP活力测定可作为诊断某些疾病的辅助指标[2]。因此，在临床诊断中简单、准确地测定血清中ALP的活性是非常重要的。测定ALP活性的方法主要有分光光度法[1,3,4]，电化学方法[5,6]、化学发光法[7,8]和荧光法[9～14]等。临床推荐使用的检测ALP方法是利用对硝基苯磷酸酯作为底物的分光光度法和磷酸苯二钠作为底物的氨基安替比林比色法[1,3,4]。通常，荧光法的灵敏度较分光光度法高约两个数量级，且和分光光度法一样具有所用仪器简单、操作方便及易于实现操作自动化等优点。本实验选择水杨酸磷酸酯(SP)作为荧光底物，SP在4

7、℃的低温条件下，至少可稳定一个月。在实验条件下，合成的新底物SP稳定性好，荧光背景很低。而SP被ALP水解后生成强荧光产物水杨酸（SA），反应机理如下。   荧光分子SA中含有共轭π键且SA分子取代基之间形成氢键，从而加强了分子的刚性结构，使其荧光强度增强，且生成的SA的量与参与反应的ALP活力呈线性关系。据此建立了荧光法测定ALP活性的新方法。　　2 实验部分　　2.1 仪器   　　RF540型荧光分光光度计和UV265型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；PHS3B型酸度计（上海雷磁仪器厂）；离心机（上海手术机械厂）。　　2.2 试剂   　　水杨酸磷酸

8、酯(SP)参照文献[15]合成并纯化，将10.0gSA与15.0gPCl5混合使之在室温下反应，直到反应平缓下来，然后用60～65℃水浴搅拌加热1.5h。用冰水浴将反应混合物冷却，然后依次加入25mL苯、25mL丙酮和3.5mL水。将混合物冰水冷却30min后，加入50mL苯，再放置24h。经真空干燥过夜后，用丙酮和苯的混合物重结晶，可得7.99gSP（产率约51%）。测得其熔点为163～165℃，与文献[15]报道的162.5～163℃基本符合。底物C、H含量用元素分析仪（美国PE2400）测定（%，括号为理论值）：测得值为：C38.50（38.54）,H3.2

9、6（3.24）。   　　工作液的配制：准确称取0.1090gSP，溶于少量0.10mol/LTrisHCl缓冲溶液(pH9.0)中，并以此缓冲溶液定容至500mL容量瓶，得1.00mmol/L工作液（可稳定一个月以上）。碱性磷酸酶(ALP，分析纯，Sigma公司，17U/mg)储备液的配制：准确称取0.0441gALP，溶于少量0.10mol/LTrisHCl缓冲溶液(pH=9.0)中，并以此缓冲溶液定容至250mL容量瓶，得3.00U/mL储备液。使用时以0.10mol/LTrisHCl缓冲溶液(pH9.0)逐级稀释得工作液。水杨酸(SA，分析纯，北京