地高辛标记探针的southern 杂交

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1、地高辛标记探针的Southern杂交（DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI，Cat.No.11745832910，RocheDiagnosticsGmbH，Germany）1.探针标记步骤（20µl体系）：1)将10ng-1µg这个需要测好。可能是1µl也可能是4µl。还可以是300ng-3µg。模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。2)沸水浴或干浴锅98℃10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3)充分混匀DIG-highPrimer（1#管），并取4µl至变性DNA管，混匀并离心？10秒钟，离

2、心到管壁无水挂即可。。4)37℃温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。5)停止反应，加2µl0.2MEDTA（pH8.0）或65℃加热10分钟-20℃保存备用。。2.探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的controlDNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下：1)根据表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，

3、将试剂盒提供的controlDNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及controlDNA表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量TemplateDNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng表2探针DNA及ControlDNA系列表TubeDNA(µl)FromTube#DNAdilutionbuffer(μl)Dilutio

4、nFinalconcentration1 Dilutedorginal  1ng/µl2211981:10010pg/µl3152351:3.33pg/µl452451:101pg/µl553451:100.3pg/µl654451:100.1pg/µl755451:100.03pg/µl856451:10总的稀释比例是：1:1050.01pg/µl90-50-01)将上述稀释的2-9号管的controlDNA及探针DNA各取1μl点膜2)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟3)将膜放入装有20mlMaleicacidbuffer的塑料器皿中，室温振荡2分

5、钟4)将膜放入10mlBlockingsolution中室温温育30分钟5)将膜放入10mlAntibodysolution中室温温育30分钟6)用10mlWashingbuffer洗2次，每次15分钟7)在10mlDetectionbuffer平衡2-5分钟8)将膜放入2ml新配制的Colorsubstratesolution中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相染色至0.1pg的ControlDNA出现斑点，比较标记的探针与ControlDNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.

6、1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。（转膜被省略。Capillarytransfer1%琼脂糖凝胶，40V电泳过夜，切角标记。对于植物基因组，去嘌呤实验不要超过20min。）去嘌呤缓冲液：placethegelinaplastictray.coverwith250mMHClpartialdepurination.

7、agitategentlyuntilthebromophenolblue溴酚蓝dyeturnsyellow(5minutes).agitateafurther15minutesandrinsewithdistilledwater.碱变性液：1.5mol/LNaCl,0.5mol/LNaOH中和液：0.5mol/LTris-HCL(pH=8.0),1.5mol/LNaCl20×SSC：2mol/LNaCl,0.3mol/L柠檬酸钠（pH=7.0）2×SSC：0.3mol/LNaCl,0.03mol/L柠檬酸钠（pH=7.0）关于凝胶处理Note:donotput

8、ethidiumbromideinto