第十四章基因诊断和基因治疗

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1、第十四章基因诊断和基因治疗表型的改变是由基因异常造成的表型的改变是由基因异常造成的讲授内容及要求一、基因诊断的基本概念二、基因诊断的基本技术三、基因诊断的应用四、基因治疗:概念、方式、程序、应用第一节基因诊断基本概念和流程传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断表型的改变是由基因异常造成的基因的改变是引起疾病的根本原因传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标

2、的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断一.概念基因诊断：应用分子生物学技术,从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在,变异和表达状态从而对疾病作出诊断的技术DNA诊断RNA诊断基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义二、基因诊断的特点针对性强：以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断”

3、。特异性高：以分子杂交技术为基本原理灵敏度高：基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人类长达3×106kb的基因组中检测出某一基因的单碱基改变。而且待测标本微量。早期诊断：基因诊断不仅可对有表型出现的疾病作出明确诊断，它还可在产前早期诊断遗传性疾病，可检出感染疾病潜伏期的病原微生物、还可预测和早期发现某些恶性肿瘤。适应性强：基因探针可为任何来源，任何种类，探针序列可为已知亦可未知，检测目标可为内源基因亦可外源基因，诊断范围广。样品抽提PCR扩增分子杂交杂交信号检测DNARNAcDNA三.基因诊断的基本流程第二节基因诊断的基本技术核酸分子杂交PCR限制性

4、片段长度多态性分析(RFLP)DNA序列测定DNA芯片技术一、核酸分子杂交（hybridization）这是应用最广泛的一类基因诊断技术根据碱基互补配对原则，将样品DNA/RNA双链经变性处理，加入已标记的单链DNA/RNA探针，样品中与探针互补的DNA/RNA序列可与探针形成杂交双链DNA，通过显示标记物或其它方法来检测特定的核酸片段。分子杂交技术过程☆探针制备及标记（同位素或非同位素）☆待测核酸样品制备（分离，纯化）☆杂交（液相，固相）☆杂交后处理（去掉非特异杂交分子）☆显示结果（显色，发光，放射自显影）☆结果分析分子杂交的基本方法原位杂交斑点印

5、迹杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交（一）原位杂交不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片上）和细菌菌落（复印至滤膜上）与标记核酸探针杂交。可测知特定基因的存在或表达状况。还可观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。（二）斑点印迹杂交把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与标记核酸探针杂交。通过纤维素膜杂交斑点的放射自显影或胶片斑点的光吸收值扫描可以测定待检核酸的含量。可检测特定基因的存在或表达情况。(三)Southern印迹杂交1975年，英国Southern创建概念:将制

6、备的DNA经酶切电泳、再转印到固相支持物上，用探针杂交后进行检测的方法，用于DNA/DNA杂交。该方法主要用于检测基因组中待测的基因或序列(四)Northern印迹杂交检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳Northern印迹杂交主要用于观测各种基因转录产物的大小、转录量以及转录产物特性分析。总RNA/mRNA→变性电泳分离→转移→杂交→放射自显影/化学显色二、PCR技术基本原理－DNA复制三个步骤变性(denaturation)退火(annealing)延伸(extension)通过PCR能扩增出所需

7、的特异性条带PCR的原理标准的PCR反应体系10X扩增缓冲液：10ul模板DNA:0.1~2ug引物：各0.2~1umol/L4种dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U总体积：100ul三、限制性片段长度多态性（RFLP）:限制性核酸内切酶能够识别特定的DNA序列，并在其中的某一特定碱基位点（限制性位点）将DNA切断，使DNA形成限制性片段.粘性切口平端切口RFLP技术珍断疾病的机理:由于基因突变的结果,使DNA上原有的核酸内切酶的识别序列发生改变,导致使用限制酶去切割时得到的结果与不发生突变的结果完全

8、不同,可借此做出诊断.如:某些遗传性疾病发生特异的点突变,而点突变位置正好是某些酶的识别和切割点,可用酶切方