ck19 rt-pcr方法检测上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中肿瘤细胞

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1、CK19RT-PCR方法检测上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中肿瘤细胞北京医科大学学报1999年第5期第31卷技术方法作者：赖娟　李蔚范　钱和年　冯捷　李海玲单位：北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044　　近年来，大剂量化疗辅以外周血干细胞移植来缓解化疗后骨髓抑制已经成为上皮性卵巢癌病人很有前途的一种治疗方法。虽然这一方法使许多病人获得了较长的无瘤生存期，但仍有部分病人最终复发，其中可能的原因之一即为回输的干细胞中含有肿瘤细胞。另外，外周血中含有肿瘤细胞的病人远处转移可能性大，预后可能不好。所以，建立一种高度灵敏的

2、检测方法来检测病人外周血干细胞及外周血中肿瘤细胞具有重要的临床意义。我中心尝试了将细胞角蛋白19(CK19)反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法应用于上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中肿瘤细胞的检测，报告如下。　　1　材料与方法　　选用CK19免疫细胞化学染色阳性的SKOV3卵巢癌细胞株检测CK19RT-PCR方法的灵敏度。设计一组梯度模型：将SKOV3细胞倍比稀释加入到CK19阴性的107个正常人血单个核细胞中形成1∶10～1∶106梯度。取阴性对照29例检测此方法的特异性。包括外周血干细胞3例4份标本：多发性骨髓瘤1例，非

3、霍奇金病1例，急性粒细胞性白血病1例；外周血26例26份标本：健康女性志愿者7例，卵巢良性上皮肿瘤11例，卵巢非上皮来源肿瘤4例，子宫良性病变4例。　　根据CK19核酸序列［1］设计CK19套式引物，用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照。　　每份样品用淋巴细胞分层液（密度1.0772　kg·L－1）梯度离心提取单个核细胞，Tris-NH4Cl溶红缓冲液溶解其中的红细胞，台盼蓝活细胞染色液计数后Trizol试剂（美国，Gibco）提取细胞总RNA，紫外分光光度计进行RNA定量。取1μgRNA完成cDNA第一链的合成。1　μl

4、反转录产物加入少量GAPDH及CK19外引物进行第一步PCR反应，体系25　μl，95℃变性1　min，70℃退火、延伸2　min，35个循环。第一步PCR产物稀释50倍，加少量CK19内引物，体系25　μl，95℃变性1　min，64℃退火、延伸1　min，35个循环。5　μlPCR产物60g·L－1聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色。306　bp为GAPDHmRNA特异扩增片段，438　bp为CK19mRNA特异扩增片段。　　2　结果　　卵巢癌细胞株SKOV3倍比稀释法制成的1∶10～1∶106梯度模型经过套式PCR后在4次1∶10

5、6模型中均可见到CK19mRNA特异带438　bp，灵敏度至少为1∶106，相当于1　ml全血中含有一个肿瘤细胞。　　对照组中3例非上皮性恶性肿瘤患者的4份外周血干细胞CK19RT-PCR检测均阴性。26例良性肿瘤病人及健康志愿者的静脉血中24(92.3％)例CK19RT-PCR阴性，2(7.7%)例阳性，2例阳性为健康女性志愿者。　　3　讨论　　目前国内、外报道的肿瘤细胞检测方法有：HE染色、免疫细胞化学、细胞培养、流式细胞计、PCR等。一般认为PCR是灵敏度最高的一种方法。RT-PCR法已被运用于实体瘤肿瘤细胞的检测，这种方法要

6、求肿瘤细胞必须特异地表达某种可以提示肿瘤来源的基因，而这种基因在肿瘤转移处的正常组织中却不表达，灵敏度可达1∶105～1∶107。目前报道的RT-PCR已有用前列腺特异抗原(PSA)检测前列腺癌细胞［2］；用EWS/FLI1或ERG检测Ewing's肉瘤细胞［3］；用神经内分泌蛋白基因产物9.5(PG9.5)或酪氨酸羟化酶检测神经母细胞瘤细胞［4，5］；用CK19检测乳腺癌等上皮来源肿瘤细胞［6，7］等。有关外周血干细胞和外周血中肿瘤细胞检测在卵巢癌中研究很少，仅见Ross［8］所研究的免疫细胞化学法，RT-PCR法未见有报道。CK

7、19是酸性角蛋白中的一种，根据Traweek等［9］的研究，CK19不在正常淋巴结、外周血和骨髓中表达，因此CK19RT-PCR方法可用于上皮来源肿瘤在这些部位的微小转移病灶的检测。另外，VanNiekerk等［10］认为CK19在上皮性卵巢癌中阳性表达率为98.4%。所以，CK19RT-PCR法可能用来检测上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中的肿瘤细胞。　　本实验用CK19套式RT-PCR方法检测上皮性卵巢癌细胞，灵敏度至少为1∶106，明显高于目前报道的免疫细胞化学法1∶5×105［8］。实验中CK19RT-PCR方法检测上皮

8、性卵巢癌细胞特异性为92.3%(24/26)。有关CK19RT-PCR方法检测上皮来源肿瘤细胞的假阳性问题文献报道不一，Datta［6］和Moscinski［7］两个小组分别用CK19套式RT-PCR检测乳腺癌病人的肿瘤细胞，假阳性3