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《1.红曲色素与桔霉素的分析 - 福州大学现代教育技术中心》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、红曲中桔霉素的分析检测报告人：徐国亮080300116桔霉素的理化性质桔霉素含一个羧基,有两种形式:离子态和非离子态(羧基和相邻的酮基及羟基形成分子内氢键),其分子式为C13H14O5,分子量250。在无水乙醇或苯-环己烷中结晶呈柠檬黄针状结晶,溶点:175℃。溶于极性有机溶剂，溶于氢氧化钠，碳酸钠和碳酸氢钠稀溶液.难溶于水。桔霉素的化学性质红曲色素能够与FeCl3、Br2、KMnO4反应，呈阳性，溶于95%的乙醇呈黄色，加H2O2后褪色，然后变浅褐色，加入0.1MH2SO4变成橙黄色，在加0.2MNaOH又恢复酒红色。桔霉素的形成机理在红曲霉培养时,首先由一个乙酰辅酶A分子和四
2、个丙二酰辅酶A分子缩合成戊酮,然后分经两条途径:一条途径是此戊酮再与丙二酰辅酶A分子缩合成己酮,最后生成红曲色素；另一途径是此戊酮经甲基化、缩合、还原、烷基化、还原、氧化、脱水等步骤,最后生成桔霉素。桔霉素的处理方法：1)加热处理；2)氧化处理；3)微波处理。红曲色素的分析检测方法抑菌圈法双向薄层层析高效液相色谱HPLC酶联免疫法ELISA抑菌圈法抑菌圈法比较简单和直接，可间接定性和半定量确定红曲中桔霉素含量，但红曲中的抗菌物质不止桔霉素一种，而且影响因素很多，因此不够准确。双向薄层层析1.制板硅胶加水调成糊状,均匀铺在玻璃板上(20cm×20cm),自然干燥后于105℃活化1h
3、,放于干燥器中待用。2.桔霉素标准溶液制备准确称量1mg桔霉素标准品,用乙醇定容至10ml,于4℃低温保藏3.待测样制备红曲样品用70%乙醇浸泡12h,离心,过滤。留上清液,低温保藏,备用双向薄层层析4.点样用微量注射器按需要量将标准品和待测样品分别点在适当位置,一般点样量不应超过10μl,样圈直径不超过5mm5.展开将展开剂按比例混合加入层析缸,展开剂的量以淹没薄板8～10mm为宜。第一相展开结束后,取出薄板放置一段时间,使展开剂自然挥发。进行第二相展开。6.紫外检测将展开后的薄板,挥发至干。于紫外灯下进行观察。展开剂正己烷:乙酸乙酯:甲醇氯仿:甲醇苯:甲醇氯仿苯:甲醇氯仿氯仿
4、:甲醇:水二氯甲烷:丙酮氯仿:丙酮正己烷:乙酸乙酯石油醚:甲醇:氯仿甲苯:乙酸乙酯展开剂配比5:3:28:330:10:985:3:1265:25:49:19:120:130:9:96:3:1展开情况*********************展开效果黄色素分开三种都没有黄桔红都分开，但是分离不清楚黄桔红都分开，但是分离不清楚三种色素都没有分开黄色素分开黄色素分开三种都没有黄桔红都分开，分离清晰黄色素分开展开剂第一相分离红曲中除桔霉素外的其他成分,第二相主要分离桔霉素。采用这种方法可避免其他成分对桔霉素荧光点的视觉干扰。实验结果表明,利用双向展开法,可以检测出红曲中的桔霉素。具体展
5、开相,第一相点标准品及样品,展开剂选择氯仿∶丙酮(9∶1)。第二相侧向展开,展开剂选用苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶3∶1),展开结束,晾干。在紫外灯下可见清晰的绿色荧光。根据第二相展开的Rf值可确定为桔霉素。第一相洗脱液第二相洗脱液1.制板双向薄层层析流程2.标准液制备3.待测样制备4.点样5.展开6.紫外检测红曲样品双向展开示意图第二相第一相高效液相色谱法高效液相色谱法能精确测定红曲中桔霉素含量，采用紫外检测器，需对样品进行预处理和板层析，最低检测浓度为１mg/L；采用荧光检测器，由于桔霉素本身具有在激发态下产生荧光的特性，而其它色素在这一波长范围内不具备激发荧光的条件，因而不需对
6、样品进行预处理，桔霉素的测定也不受干扰，检测结果的重现性好。各国的桔霉素检测方法香港中文大学Hin-chungWang等采用先酸化沉淀，将滤出液冷冻干燥后再相继用95%的乙醇和乙酸乙酯萃取，蒸干后溶于苯，用色谱柱分离，收集相关部分进行TLC分析法国科学家Blanc采用氯仿(或乙酸乙酯）从酸化后的培养液中萃取桔霉素，再进行HPLC分析;对固态红曲样品，先用乙腈萃取，萃取液加等体积水、酸化，再用氯仿萃取，最后溶于甲醇，进行HPLC分析荷兰科学家Monica等用等体积的氯仿和甲醇萃取红曲样品，萃取液经真空浓缩至干、溶解于流动相，进行HPLC分析在日本国标法中，红曲色素产品桔霉素检测，预
7、处理的方法是先用柱色谱分离色素。即称取一定量的红曲色素，放入分离柱中，用甲醇:水(体积比7:3)作洗脱剂，收集一定时间内的流出液(内含桔霉素)，用HPLC荧光检测.高效液相色谱法红曲样品的预处理高效液相色谱分析流动相PH色谱柱萃取次数实验比较了ZORBAXEclipseXDB-C18(5μm,250X4.6mm),ZORBAXSBC18(5μm,250X4.6mm),NUCLEOSILRP18(5μm,250X4.6mm)这三根C18柱对桔霉素定性定量检测的影响。色谱柱ZORBA
