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1、RNA干扰技术的原理与应用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是通过小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)造成目的mRNA特异性降解,从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界,是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制,为稳定基因组发挥了重要作用。由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命,并将加快这个领域的研究步伐。1RNAi现象的发现及发展1995年,Guo等用反义RNA阻断秀丽新
2、小杆线虫的part1基因的实验中发现,正义和反义RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义RNA技术的解释相反。1998年2月卡耐基研究院的Fire等将双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)转入细胞内,发现靶基因的mRNA发生了降解,证实高度纯化的dsRNA可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链RNA至少高2个数量级,首次揭示了Guo等遇到的现象,即为RNAi。随后研究发现,RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制,RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加
3、速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。在短短几年中,对RNAi的研究取得了突飞猛进的发展,许多令人振奋的报道相继出现,2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用RNAi技术抑制基因表达,开创了RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河;2002年,Kay研究小组首次报道了应用RNAi技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组siRNA文库新技术和应用基因组siRNA文库,从全基因组
4、水平对高等动物基因功能进行高通量RNAi研究。这些研究成果愈来愈表明,生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分RNA。2RNAi的作用机制细胞中dsRNA的存在是RNAi形成的先决条件。dsRNA可以通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。通过对RNAi所进行的遗传学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。RNAi的作用机制可分为三个阶段:起始阶段、效应阶段和级联放大阶段。起始阶段:由RNA病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的dsRNA分子在细胞内被一双链RNA酶!型内切酶
5、也叫Dicer酶或Dicer核酸酶同源物剪成21~23ntsiRNA,3’端带有2个碱基突出的黏性末端,5’为磷酸基团,此结构对于siRNA行使其功能非常关键。剪切位点一般在U处,具特异性。效应阶段:RNAi特异性的核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶、辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA结合成RNA诱导沉默复合体RISC(RNAinducingsilencecomplex,RISC)识别靶mRNA,其中的反义链与靶mRNA互补结合,正义链则被置换出来。继而,RISC复合物中的RNase(可能是Dicer
6、)在靶mRNA与siRNA结合区域的中间将其切断。级联放大:在RNA依赖性RNA聚合酶的作用下,以mRNA为模板,siRNA为引物,扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶,产生更多的siRNA,从而使效应阶段反复发生,一个完整的mRNA被降解成多个21~23nt的小片段,从而导致相应的基因表达沉默。在这一过程中的多个步骤都需要ATP,如RISC复合体的形成、siRNA与靶mRNA的配对、靶mRNA的切割。另外,在dsRNA复制过程中,两条链的分离可能也需要一个依赖ATP的RNA解旋酶。dsRNA
7、可通过细胞微管在细胞间传递,实现dsRNA在整个个体中的散布。RNAi在植物、线虫、果蝇等低等模式生物中,都可由dsRNA诱导,在哺乳动物细胞中,>30bp的dsRNA会引起干扰素效应和非特异性基因抑制,导致mRNA非特异性降解,是医疗上应用RNAi的一大障碍,随后发现合成双链的只有19~21nt的siRNA却可以避免这种效应,特异性发挥RNAi作用,并发现在哺乳动物细胞中转入双链RNA(dsRNA)后导致转录后基因沉默比用核酶或反义RNA更彻底、更有效。Elbashir等通过瞬时转染体外合成的21nt双链si
8、RNA成功诱导出了哺乳动物细胞的RNA,i且避免了dsRNA引起的非特异性反应,这为RNAi技术在基因治疗领域的研究铺平了道路。3RNAi的作用特点3.1高特异性RNAi是转录后水平的基因沉默机制,有高度的序列特异性,19nt的dsRNA几乎可以完全抑制基因的表达,而其中的1nt突变后,它对基因的抑制作用就消失了,这种高度的序列特异性能够使dsRNA非常特异地诱导与之序列同源的m
