生物选修三(现代生物科技)

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1、DNA重组技术的基本工具培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：形成重组DNA关键步骤三：重组DNA导入受体(棉花)细胞一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来2、种类：4000种3、作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。4、结果：形成两种末端：黏性末端和平末端大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。黏性末端被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有

2、几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。平末端当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。二、基因的针线──DNA连接酶DNA连接酶连接形成磷酸二酯键DNA连接酶和DNA聚合酶的比较比较DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接DNA片段（

3、双链）连接游离的脱氧核苷酸（单链）不需要模板需要模板相同点连接不同脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖导入过程需要运输工具——运载体运载体必须同时满足四个要求：①能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达；②具有多个限制酶切点，便于与目的基因结合；③具有某些标记基因，便于筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）④对受体细胞无害，易分离运载体的作用：1、作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的运载体：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等质粒质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存

4、在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。基因工程的基本操作程序基因的结构（原核细胞）RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。非编码区：不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质编码区：能够转录

5、为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质真核细胞的基因结构外显子:能够编码蛋白质的序列叫做外显子内含子:不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA信使RNA前体信使RNA真核细胞的基因在转录时内含子和外显子是一起转录的，因而转录产生的mRNA必须经过加工，将内含子转录部分剪切掉，将外显子部分拼接起来，才能成为有功能的成熟的mRNA。原核生物的基因由于不含有外显子和内含子，因此，转录产生的mRNA不需要剪切、拼接等加工过程。原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的编码区是间隔的、不连

6、续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的基因工程操作的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。目的基因的制备?目的基因就是所需要克隆的外源基因（主要指编码蛋白质的结构基因）?制备方法：1、人工合成法2、逆转录法3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中离4、用PCR法扩增目的基因片段5、从基因文库中获取目的基因的制备：人工合成法?较小分子基因可用人工化学合成的方法获得?人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的?缺点是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因时遗传密码

7、的兼并现象会为选择密码带来很大困难；3、费用较高目的基因的制备：逆转录法?若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。?该法是：以编码某特异多肽的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反转录成该多肽mRNA的互补DNA（cDNA）；再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA。可用于真核生物目的基因的获得?用逆转录法合成cDNA的主要问题是：1、mRNA必需提得很纯2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物，3、以单链cDNA为模板往往难以合成与单链cDNA一样长的ds－cDNA，这与实验技

8、术有关。用限制酶切法直接从染色体DNA中分离?此方法主要适用于制备原核基因?对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶把目的