02 生物化学实验--酚试剂法(改良lowry法)测定血清蛋白质含量

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1、酚试剂法（改良Lowry法）测定血清蛋白质含量【目的】1．掌握酚试剂法测定蛋白质含量的含量与操作技术。2．熟悉标准曲线的制作方法和分光光度计的应用。【原理】蛋白质分子中所含的肽键在碱性溶液中与Cu2+络合产生紫红色化合物(双缩脲反应)，同时使肽链展开，其中带有酚基的酪氨酸残基充分暴露，后者在碱性条件下使酚试剂中磷钨酸-磷钼酸还原，生成钼蓝和钨蓝的化合物，其蓝色深浅与蛋白质含量成正比，与已知浓度的标准蛋白质溶液进行比色，即可计算出测定样品中蛋白质的含量。酚试剂法测定样品中蛋白质的含量，其特点为方法简便，灵敏度高，能够测定2～100μg的微量蛋白质。其方法比凯氏定氮法操作

2、简便，其灵敏度比双缩脲法高100倍左右。因此经常被用于科研与临床检验。【器材】1．座标纸2．50ml容量瓶3．722型分光光度计【试剂】1．碱性铜试剂甲液称取无水碳酸钠2.0g，溶于0.1mol／L氢氧化钠溶液100ml中。乙液取硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.5g溶于1％酒石酸钾溶液100ml中。临用前取甲液50ml,乙液1ml混合，即为碱性铜试剂。2．标准蛋白质溶液(0.25g/L)准确称取结晶人血清清蛋白25mg，溶于0.9％氯化钠溶液中，以容量瓶定容至100ml。3．0.9％氯化钠溶液4．酚试剂（有成品出售）取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g和钼酸钠

3、(Na2MO4·2H2O)25g,溶于700ml蒸馏水中，再加入85％磷酸50ml和浓盐酸100ml混合，置于1500ml圆底烧瓶中温和地回流10h，回流结束后加入硫酸锂(LiSO4·H2O)150g，水50ml，溴3～4滴，除去回流装置，继续沸腾15min，以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml，过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能使用，应继续加溴煮沸)。试剂配置好后置于棕色瓶中保存。使用前，以酚酞为指示剂，用0.1mol／LNaOH溶液滴定，求出酚试剂的摩尔浓度。然后根据此浓度，将酚试剂用蒸馏水稀释至最后浓度为1mol／L(滴定时可将酚试剂稀释，以免颜色影

4、响)。试剂放置过久，变成绿色时，可再加溴数滴煮沸15分钟，如能恢复原有的金黄色仍可继续使用。【操作】1．标准曲线的制备取试管6支编号，按下表进行操作试剂（ml）123456标准蛋白溶液00.20.40.60.81.00.9%NaCl1.00.80.60.40.20碱性铜试剂5.05.05.05.05.05.0分别混匀，室温放置20分钟酚试剂0.50.50.50.50.50.5混匀，室温放置30min后，以第1管为空白管调零点，在波长650nm比色，分别读取各管吸光度值。以蛋白质浓度为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线。2．血清蛋白质测定取血清0.1ml，置于50m

5、l容量瓶中，用0.9％氯化钠溶液稀释至刻度处，混匀，此为待测血清样品。另取3支试管，标明测定管，标准管、空白管，按下表进行操作：试剂（ml）测定管标准管空白管稀释血液0.4——标准蛋白溶液—0.4—0.9%NaCl0.60.61.0碱性酮试剂5.05.05.0混匀，室温放置20分钟酚试剂5.05.05.0混匀，室温放置30分钟后，在波长650nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。【计算】1．标准曲线法以测定管吸光度值查标准曲线，求得稀释血清蛋白质含量，再乘500即得血清蛋白质含量（g/L）。2．标准管法【注意事项】1．各管加入酚试剂后应立即摇匀，不应出现浑浊。2

6、．碱性铜试剂必须新鲜配制。3．本实验对不同蛋白质定量变动较大，凡具有还原性的物质对此实验都有干扰。4．本法测定血清蛋白质含量正常值为7～10g/dl。【思考题】1．试述标准曲线法与标准管法定量蛋白质的优缺点。2．试述酚试剂法（改良Lowry法）测定血清蛋白质含量的优缺点。