高效稳定纤维素菌群的筛选及其特性研究 2

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1、高效稳定纤维素分解菌群的筛选及其特性研究王得武1，姚拓2，杨巧丽1，韩华雯2，张英2，卢虎2，滚双宝1*（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070；2.甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州730070）摘要：为获得能够在常温条件下（28~35℃）快速分解纤维素的微生物群体，以限制性培养技术从牛、鸡粪混合储粪池土样筛选了一组纤维素分解菌群，利用失重法测定了该菌群对不同纤维材料的分解能力，并采用固体平板技术对其菌株组成及其特性进行了研究。结果表明，筛选的纤维素菌群48h可将培养基内滤纸分解成糊状；6d对滤纸、玉米秸杆、

2、稻草秸杆、小麦秸杆、柞木木屑和杨木木屑分解率分别为94.95％、48.52％、45.05％、44.30％、11.00％、1.22％；在发酵液初始pH5~11的范围内，对滤纸分解率超过84.59％，并将反应体系pH最终调节稳定在8.5~8.8；经分离纯化得到的8株真菌、6株细菌和3株放线菌相互接种构建的人工菌群不具备纤维素分解能力。纤维素分解菌群能够高效分解纤维素，对秸杆类木质纤维素也具有很强的分解能力。关键词：纤维素分解菌群；纤维素分解；木质纤维素；pH纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的可再生资源，广泛存在于园林、秸秆、

3、畜禽粪便等有机固体废弃物中[1,2]，当前这些资源利用率极低，在浪费能源的同时对环境造成了污染。利用微生物技术是实现这些废弃物资源化和解决环境问题的一种有效途径。目前应用和研究的纤维素分解菌多为单菌株，如工业生产纤维素酶的微生物菌种大多都是丝状真菌，然而单菌株往往存在纤维素酶系不健全、酶活不稳定、酶作用pH范围狭窄及产酶成本高等问题，对纤维素分解能力有限[3,4]。自然界中，纤维素在多种微生物共同作用下被分解从而进入地球的碳素循环，多种微生物的协同作用在纤维素分解过程中非常重要。因此，近年来微生物群体功能的研究越来越受到关

4、注[2,5-8]。崔宗均等[2,5,6]利用限制性培养技术和优化组合方法，培养出了高温条件下具有很强活力的纤维素复合菌系，但在常温条件下受到一定的限制。本研究以畜禽粪便储粪池中土样为原材料，筛选出了一组在常温条件可高效降解纤维素的微生物群体，并对该菌群的木质纤维素分解能力、不同pH环境下的适应能力及其菌株组成进行了研究，以期为其进一步研究与推广应用提供理论依据与技术支持。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种来源森林腐殖质、腐烂的玉米秸杆、牛场料槽旁边土样、麦垛底部土样和牛鸡粪混合储粪中土样。1.1.2培养基蛋白胨5g，酵母

5、膏5g，纤维素（新华滤纸）5g，NaCl5g，CaCO32g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.5mg，MnSO4·H2O0.16mg，ZnSO4·7H2O0.16mg，CoCl20.2mg，加蒸馏水至1000mL，pH7.0，121℃灭菌25min。1.1.3纤维材料滤纸以1%醋酸浸泡过夜后，用蒸馏水反复浸泡洗至中性，80℃烘干备用。秸杆和木屑粉碎过1mm筛，蒸馏水煮沸十分钟，以三层沙布过滤冲洗，80℃烘干恒重后备用。1.2纤维素分解菌群筛选取5g土样接入100mL培养基内培养，命名

6、为第1代，待培养液中滤纸分解至不再明显变化，取菌液5mL接入新鲜培养基内，重复接种，接依次为2、3、4……n代。根据滤纸条的断裂程度判断降解效果：（+）滤纸边缘膨胀；（++）为滤纸边缘不定形；（+++）滤纸整体不定形；（++++）滤纸成团糊状；（+++++）滤纸完全成糊状。培养过程中，淘汰分解能力不稳定及分解能力退化的菌群。培养条件：28~35℃，80r/min微震。1.3纤维素分解菌群对不同纤维材料分解能力测定分别以0.5g的滤纸、玉米秸杆、稻草秸杆、小麦秸杆、柞木木屑和杨木木屑为培养基唯一碳源制作100mL培养基，接种

7、5mL纤维素分解菌群，培养条件同1.2，6d后测定不同纤维材料的分解量（失重量），计算分解率（失重率），具体方法如下：参考测定饲料粗纤维使用的尼龙袋技术[9]及测定土壤纤维分解强度使用的尼龙网袋法[10]，利用38μm尼龙袋过滤培养基，再用蒸馏水冲洗，烘干，称量，恒重，计算。纤维材料分解率＝（纤维材料原质量+尼龙袋质量－烘干后纤维材料与尼龙袋质量和）/纤维材料原质量×100%。1.4纤维素分解菌群对不同初始pH值培养基pH的影响及滤纸分解能力测定以滤纸为培养基唯一碳源制作100mL培养基，将培养基初始pH值调至5、6、7、

8、8、9、10、11，分别接种5mL纤维素分解菌群，培养条件同1.2，每隔12h测定培养基pH值，并观察培养基滤纸崩溃的情况，待培养基pH值稳定后测定滤纸分解量，计算分解率，测定方法同1.3。1.5纤维素分解菌群单菌株分离及单菌组合后对滤纸分解能力测定培养基加入1.5%的琼脂制作固体培养基，取纤维素分解菌