凯氏定氮法测定蛋白含量原理解析

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4、牛司锋，山东公司品管部凯氏定氮法是目前蛋白质测定最常用的方法，通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，因此，此法的结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法。凯氏定氮法的原理是食品与浓硫酸、催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准

5、溶液滴定，根据盐酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即可计算出食品中的蛋白质含量。一、实验试剂1．40%氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；2．4%硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至l00mL；3．0.1mol/L盐酸标准滴定溶液；4．甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)与甲基红乙醇溶液(1g/L)按1+2体积比混合；5．蒸馏水；6．硫酸铜；7．硫酸钾；8．浓硫酸。二、实验步骤及相关原理1．样品处理称取充分混匀的固体试样0.2~2g、半固体试样2~5g或液体试样10~25g（约相当于30~40mg氮），精确至0.0001g，移入干燥的100mL、2

6、50mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g4鲁洲集团硫酸钾及20mL浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5~1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。在此过程中，主要发生蛋白质与浓硫酸在催化剂作用下进行的氧化分解反应，离子反应方程式为：-NH2＋(浓)H2SO4→(NH4)2SO4………………………………………………………

7、…………（1）2．定氮装置的检查与洗涤装好并检查定氮蒸馏装置是否装好，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠或沸石，滴加数滴甲基红指示剂及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭上方夹子，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开下方夹子由橡皮管排出，如此数次，即可使用。3．