毕设论文 脑猪心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析生.doc

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1、硕士猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析2009硕士学位论文猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析二○○九年六月硕士学位论文猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析学科专业预防兽医学指导教师教授副研究员论文答辩日期学位授予日期答辩委员会主席论文评阅人广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容

2、。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。论文作者签名：年月日学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：□即时发布□解密后发布（保密论文需注明，并在解密

3、后遵守此规定）论文作者签名：年月日导师签名：年月日猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析中文摘要脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus,EMCV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）、心病毒属（Cardiovirus）的成员，可引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。针对猪EMCVVP3/VP1基因序列设计并合成一对特异性引物，以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品，建立了检测EMCV核酸的SYBRGreenIreal-timePCR方法。该方法线

4、性关系好，标准曲线的相关系数达到0.991；敏感性高，初始模板的检出下限为1×101拷贝/μL，比常规PCR方法高100倍；特异性强，与其它猪源病毒均不发生交叉反应；重复性好，组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对临床29份可疑病料进行检测，结果1份为阳性。将该份疑似病料上BHK-21细胞，并对其进行特性鉴定，确诊为EMCV，命名为EMCV-GXLC，设计5对引物，采用RT-PCR技术扩增EMCV分离株基因组完整开放阅读框（ORF）序列，应用3′-RACE和5′-RACE技术扩增分离株的3′-UTR和5′-UTR，分

5、别进行扩增片段的克隆和测序。结果表明，EMCV-GXLC株基因组全长7725nt，编码区为6879nt，编码2292个aa，将该株全基因组上传NCBI，GenBank登录号：FJ897755。应用分子生物学软件对EMCV-GXLC全基因组核苷酸及推导氨基酸序列进行了序列比对和同源性分析。全基因组比对结果表明，分离株与来源于广西的FJ604852、FJ604853，北京的DQ464062，河北的DQ464063，韩国的DQ517424、EU780148、EU780149等猪源EMCV分离株的同源性较高，达99.5%以上。各个片段推

6、导的氨基酸同源性分析显示，非结构蛋白比结构蛋白保守；在非结构蛋白中，3D蛋白最为保守，2A相对变异较大，预示EMCV的诊断引物可以基于3D基因；在结构蛋白中，VP2蛋白相对保守，VP1蛋白同源性最低、变异性较大，适合用于分子流行病学的调查。VP1蛋白有两个潜在的N-糖基化基序，分别为N29QT和N62QT，VP1是表位最多的区域，预测有9个可能的表位；VP2和VP3共有6个潜在的N-糖基化位点。3′-UTR和5′-UTR二级结构分析显示，FJ897755与来源于韩国的DQ517424相似度最高。进化树分析显示，结构蛋白与全基因序

7、列的系统发育进化树相近，且不同结构蛋白基因序列之间的系统发育进化树结构也类似，在分析EMCV分离株的进化关系时，可以使用VP3/VP1基因来绘制系统发育进化树。关键词：猪脑心肌炎病毒；荧光定量PCR；分离；测序；全基因组；进化分析IXISOLATIONANDGENOMICSEQUENCEANALYSISOFPORCINEENCEPHALOMYOCARDITISVIRUSGUANGXISTRAIN英文摘要Encephalomyocarditisvirus(EMCV)isamemberofthegenusCardiovirusoft

8、hefamilyPicornaviridae,itisclinicallycharacterizedbyencephalitis,myocarditisorinflammationaroundcardiacmuscles.Apairofprimerswasdes