资源描述：
《离子束介导转基因技术简介》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、基因工程随堂作业题目：离子束介导转基因技术简介院（系）：专业：班级：姓名：学号：成绩：完成日期：6离子束介导转基因技术简介在植物转基因方法中,人们总是在全力寻找那些更为简单、有效而又通用的手段,以便绕过复杂的原生质体培养过程,实现带壁细胞的基因转移。于是,便开始了应用物理方法进行植物转基因的尝试,并获得了很大进展。其中较为成功的方法有电激法、基因枪或微弹轰击法、注射法、激光穿孔法和超声波法。这些方法就其本质来说,都是使细胞壁穿孔而又不伤害细胞,提供外源基因进入受体细胞的通道。20世纪80年代末,由于受到离子注入金属、半导体等
2、材料进行表面改性、掺杂等研究的启示,中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人,率先尝试将离子注入技术应用与生物材料,进行农作物品种的改良,并于1986年首次获得成功。至此,一个新兴的交叉学科离子束生物工程学问世,并日益受到国内外专家的关注。1991年余增亮等提出了离子束介导外源基因转移的设想,随后成功获得了水稻转基因植株。离子束介导转基因技术打破了传统的转基因法(PEG法、电击法、脂质体法等)操作繁琐,转化率低,重复性差,基因型依赖性强的限制,是一种较简单易行的转基因方法。1.离子束介导转基因技术的原理植物细胞表面存在细胞壁,
3、是外源基因转移的天然屏障。所有的转基因方法都是通过打破这一屏障,或以易于外源基因导入的细胞或组织(如原生质体、萌发胚、子房和幼穗等)作为受体而实现的。离子束介导转基因的原理主要包括了3个方面,即通道作用、吸引作用和整合作用。首先,一定能量和剂量的离子束对植物细胞壁的溅射作用破坏细胞壁和细胞膜的结构,结果在局部产生刻蚀和穿孔,为外源遗传物质进入细胞提供微通道,这就是离子束对生物体的通道作用。其次,用于注入的荷电正离子降低了细胞表面的负电性(沉积作用),从而减弱了对带负电的外源DNA的静电斥力,从而促进了外源DAN的吸附和进入,
4、即产生吸引作用。再者,离子束的直接和间接作用打断细胞内的染色体DNA结构,有利于外源遗传物质整合到受体基因组中,即整合作用。2 离子束介导转基因方法2.1 注入离子类型离子束介导转基因技术目前所用的元素离子种类主要有2种:N+和Ar+。安徽省开展离子束介导转基因较早,多用Ar+作为注入离子。他们认为Ar+是一种惰性元素,不会与生物靶组织发生化学反应而沉积下来,最终以氩气的形式逸出靶面。卞坡等进一步研究表明,在相同的能量和剂量下,Ar+的刻蚀效果优于N+。但是,吴丽芳等研究认为,用相同剂量、相同能量的N+和Ar+处理小麦成熟胚
5、,结果两种离子对小麦成熟胚出愈率的影响差异不显著。河南省在进行外源大分子DNA转移时,多用N+注入,其变异效果和三代的稳定情况并不比用Ar+的差。看来,拓宽离子束介导转基因所用的注入元素离子的种类,仍是今后研究的重点。2.2 注入离子的能量和剂量注入离子的能量、剂量和脉冲剂量直接关系到离子束介导转化的效果。吴丽芳等研究认为,用离体小麦成熟胚为受体,以GUS基因(GFP基因)为供体,选用的离子注入能量在20～625keV时,介导转基因效果较好。在能量为25keV,脉冲剂量为2.6×1015N+/cm2条件下,对小麦成熟胚进行处
6、理,发现低剂量处理未导致出愈率降低,反而略有升高。然而,当剂量大于5×1016ions/cm2时,会导致出愈率急剧下降。他们认为,选用4.68×1016ions/cm2作为离子束介导转基因的注入剂量较为合适。吴丽芳等在以外源大分子裸露DNA为供体,成熟种子胚为受体(不是离体胚)时,所用的照射能量为30keV,剂量为7×1016Ar+/cm2。苌收伟等用俄罗斯制造的TITAN全元素注入机,进行离子束辅助外源DNA转移时,所用的照射能量为30keV,束流200mA,脉宽400ms,频率25Hz,剂量为2×1017N+/cm2。看
7、来,不同的离子注入机在进行转基因操作时,要摸索合适的参数条件。3 .离子束介导转基因程序3.1 受体前的处理挑选成熟种子,进行消毒。首先用70%的乙醇表面消毒1min,用无菌双蒸水冲洗干净,接着用0.1%升汞浸泡15min(或用20%次氯酸钠处理30min),然后用无菌双蒸水冲洗干净,用灭菌滤纸吸干水液。3.2 离子束注入处理将灭菌后的种子,在无菌操作台上用手术刀将胚切下,胚朝上均匀摆放在平皿中。将无菌微环境靶室用酒精灭菌,放入平皿,种胚朝离子束方向,打开直通阀,接收离子束的刻蚀,待处理完后立即将种胚侵入含供体DNA(50μ
8、g/ml)的SSC导入介质中,温育1h左右,取出种胚用SSC溶液反复冲洗3次,无菌滤纸吸干残存水液,接种到MS诱导愈伤培养基上。同时设2个对照,一个是种胚只放置在离子束注入的环境中,但不接受离子束注入处理,同样浸入含DNA的SSC介质中;另一对照是种子胚接受和处理相同的离子束处理,不含DN
