电场辅助离子束介导基因转化试验研究

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1、内蒙古大学硕上学位论文电场辅助离子束介导基因转化试验研究摘要参照常规的拟南芥室内栽培技术，建立了一种新型的MS培养基法与水培方法相结合的拟南芥室内培养体系。试验结果表明，种子萌发阶段采用MS固体培养基，苗期改用改良的1／4Hoagland营养液，可栽培出生长健壮的拟南芥植株。此方法较传统的土培法和水培法都有明显的改善。以能量为20keV，剂量为0-400x2．6x1013ions／cm2的盯离子束注入拟南芥愈伤组织，分别采用常规方法和TTC法检测离子注入后拟南芥愈伤组织的失水率和细胞活力。结果发现拟南芥愈伤组织的失水率随离子注入剂量的增加而增加，回归分析

2、显示愈伤组织的失水率与注入剂量之间有显著的线性关系；愈伤组织细胞活力随离子注入剂量变化关系为“马鞍’’型曲线，曲线回归分析表明三次方程是细胞活力随离子注入剂量变化的最佳曲线方程，250x2．6x1013ions／cm2为后续检测基因转化效率的最佳离子注入剂量。对水平电泳槽和竖直电泳槽内DNA分布情况进行了定性和定量分析，证明了DNA在电场的作用下由负极向正极泳动，得到了DNA在纯水溶液中随电泳时间的延长降解情况严重这一重要结论。设计并制作了一个新型、特殊而且有效的电泳槽用于辅助低能离子束介导基因转化试验，分别利用DNA浸泡法和DNA电泳法转pBll21质

3、粒至盯注入后的拟南芥愈伤组织，GUS检测结果表明，DNA电泳法明显优于惯用的DNA内蒙古火学硕：L学位论文浸泡法。DNA浸泡法中GUS基因的瞬时高表达只是在愈伤组织的表面部分，而且蓝色斑点较浅；而DNA电泳法得到的GUS基因的瞬时高表达己深入愈伤组织内部，而且蓝色斑点或条纹较深。当DNA电泳时间为lO分钟时，GUS基因的瞬间表达率最高(82．7％)，同时瞬间高表达频率(51．1％)要比DNA浸泡法(7．5％)高出5．8倍之多。不同处理方法的多重比较结果显示，10．15分钟是DNA电泳辅助离子束介导基因转化的最佳时间。关键词：电场，DNA电泳，离子束，转基

4、因，GUS基因，瞬间表达内蒙古大学硕士学位论文ELECTRICFIELDASSISTn呵GLOW．ENERGYIONBEAMMEDIATEDG王扑陋TRANSFERABSTRACTBasedontheconventionalindoorculturetechniquesofArabidopsisthaliana，anewmethodwhichiscomposedofMSmediumcultureandwaterculturewasdeveloped．Theresultsshowedthat，whentheseedsweregerminatedonMSso

5、lidmediumandthentheseedlingsweretransferredtoawaterculturevesselcontaining1／4Hoaglandsolution，ArabidopsisWasgrowingwell．Themethodwasobviouslybetterthanbothsoilcultureonlyandwatercultureonly．Arabidopsiscalliwereimplantedwith盯ionbeamatanenergyof20keVanddosesof0-400x2．6xl013ions／cm2

6、．ConventionalmethodandTTCassaywererespectivelyusedtotestthewaterlossrateandcellviabilityofN．implantedcalli．Theresultsindicatedthatthewaterlossrateofcalliincreasedwithincreasingdose，andanobviouslinearrelationshipbetweenthemwasfoundthroughregressionanalysis．ResultsofTTC—testindicat

7、edthat，thecellviabilitywasrelatedtothedoseofN+implantation，andshowedacharacteristiccurveshapedlikea“saddle’’．Acubicequationwasconsideredastheoptimalcurveequationbycurveregressionanalysis．Besidesthese，250x2．6xlO13ions／cm2wassuggestedastheoptimumimplantationdosetotestthetransformat

8、ionefficiency．ThedistributionsofDNAinhor