应用酵母单杂交技术筛选bmnpv多角体基因启动子结合蛋白

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1、应用酵母单杂交技术筛选BmNPV多角体基因启动子结合蛋白应用酵母单杂交技术筛选BmNPV多角体基因启动子结合蛋白李佳1高珍1王美惠1陈健1吕正兵1聂作明1张耀洲12于威1510152025303540451浙江理工大学生命科学学院杭州3100182天津市国际生物医药联合研究院天津300457摘要本研究以家蚕杆状病毒BmNPV为研究对象筛选其多角体基因高效转录过程中与启动子序列相互作用的结合蛋白通过提取感染BmNPV第5天的家蚕五龄虫脂肪体组织的总RNA利用RT-PCR技术建立了家蚕五龄幼虫组织的基因表达文库同时设计并合成了用于

2、调控因子筛选的多角体基因启动子关键序列采用酵母单杂交系统从构建的家蚕组织cDNA文库中筛选与该基因启动子相互作用的蛋白因子经过多轮筛选后共获得12个阳性克隆仍保持AbA抗性提取相应酵母菌单克隆中的质粒进行测序分析发现它们分别属于2个不同蛋白的cDNA克隆进一步对筛选出的cDNA序列进行生物信息学分析发现它们分别编码宿主来源的核糖体蛋白RPSAribosomeproteinderivedRPSA和BmNPV来源的核型多角体病毒DNA结合蛋白DBP为进一步验证筛选出的蛋白因子RPSA和DBP对多角体基因启动子活性的影响分别将RPSA

3、和DBP基因插入瞬时表达载体pSK-IE中转染BmN细胞24h后感染重组病毒Bacmid-Luc然后检测荧光素酶的表达量结果表明RPSA蛋白和DBP蛋白对多角体基因转录均具有正调控作用RNAi检测结果表明RPSA和DBP干扰后对多角体基因转录水平均具有下调作用本研究工作从分子水平探索了多角体基因启动子高效转录表达的作用机制为今后深入研究杆状病毒启动子转录机制奠定了基础关键词分子生物学BmNPV酵母单杂交系统多角体启动子DNA结合蛋白转录调控中图分类号Q78ScreeningofProteinsBindingwithpolhPro

4、moterofBmNPVbyYeastOne-hybridSystemLiJia1GaoZhen1WangMeihui1ChenJian1LvZhengbing1NieZuoming1ZhangYaozhou12YuWei11ZhejiangscienceandtechnologyuniversityHangZhou3100182TianjinIntemationalJointAcademyofBiotechnologyMedicineTianJin300457AbstractPolyhedringenepromoterplay

5、sanessentialroleinregulatingforeigngeneexpressioninBEVSbutthehigh-leveltranscriptionmechanismisstillunknownOne-hybridscreeninginyeastisapowerfulmethodtorapidlyidentifyheterologoustranscriptionfactorsthatcaninteractwithpolyhedronpromoterDNAsequenceTotalRNAwasextracted

6、fromsilkwormfatbodyoffifthinstarlarvaeinfectedbyBmNPVforfivedayscDNAforsilkwormgeneexpressionlibraryconstructionwasgeneratedbyRT-PCRtechniqueKeypolyhedronpromoterbaitsequencewassynthesizedtogeneratethebaityeaststrainwhichwasusedtoscreentheone-hybirdcDNAlibray12positi

7、veyeastcolonieswereobtainedfromSD-LeuAbAplatessequencinganalysisshowedthattheybelongto2differentproteincDNAcoloniesTheywereknownasribosomalproteinsRPSAandnuclearpolyhedrosisvirusDNA-bindingproteinDBPInordertofurtherverifytheregulationfunctionofRPSAandDBPRPSAandDBPgen

8、ewereinsertedintotransientexpressionvectorpSK-IErespectivelyThenrecombinantvectorwastransfectedtoBmNcells24hourslaterwhichhavebeeni