elisa检测原理及手足口病诊断中的作用

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1、ELISA基本原理及在手足口病实验室检测中的应用内容ELISA的基本原理ELISA的种类ELISA的组成ELISA结果判定ELISA中的几个重要影响因素ELISA的质量控制ELISA在手足口病致病病毒检测中的应用。1.ELISA的基本原理ELISA（Enzyme-linkedimmunosorbentassay——酶联免疫吸附实验）是20世纪60年代发展起来的免疫学检测技术，也是目前应用最广泛的传染病检测方法。ELISA的特点：敏感度和特异度较高，重复性好。试剂比较稳定，易于保存。操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。易于标准化和对检测对象进行

2、定量。可以自动化。抗原抗体反应抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。IgG和IgM抗体的三维结构将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。2.ELISA的种类-检测抗原竞争法ELISA——将特异性抗体包被于固相载体表面

3、，洗涤后分为两组，一组加入酶标抗原和被测抗原的混合液，另一组只加入酶标抗原，经孵育洗涤后加底物显色，两组吸光度之差就是所测定未知抗原的量。包被特异性抗体酶标抗原检测抗原孵育洗涤后显色加样AB3.显色3.孵育1.加样检测抗原双抗体夹心法ELISA——将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。检测抗原1.加样2.孵育3.洗涤4.加入二抗5.孵育6.显色酶标特异性抗体包被特异性抗体检测抗体间接法ELISA（IndirectELISA）——将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应

4、特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。1.加样2.孵育3.洗涤4.加入二抗5.孵育6.显色检测抗体捕获法ELISA（CaptureELISA）——专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。1.加样2.孵育3.洗涤4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.显色检测抗体双抗原夹心法ELISA——检测标本中的总抗体（包括IgM和IgG型抗体）。将特

5、异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色。3.洗涤1.加样2.孵育6.显色5.孵育4.加入酶标抗原3.ELISA试剂的组成固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是聚苯乙烯材质的微孔板，多为8×12道96孔板条。酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反应。辣根过氧化物酶（HorseRadishPeroxidase，简称HRP）是目前应用最为广泛的酶，是从辣根

6、菜的根中提取。碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase，简称AP）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。底物：不同种类的酶要求使用不同的底物。HRP—邻苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS『2,2‘-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)』，OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性差。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。AP—对硝基

7、苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是吐温20（聚山梨酯）。标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。RF吸附剂：在进行IgM抗体检测时，间接ELISA方法需要使用RF吸附剂去除类风湿因子的干扰作

8、用。4.结果判断S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为