心先安对缺血预处理心肌细胞组织中p53蛋白表达的影响

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1、【摘要】　　目的：观察心先安对缺血预处理心肌细胞组织中p53蛋白表达的影响，探讨心先安对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护机制。方法:将35只SD大鼠随机分成4组:正常对照组（n=5）、假手术组（n=10）、缺血再灌注损伤组（n=10）、心先安预处理组（n=10），建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内p53蛋白表达的变化。利用HPIAS-1000图文报告管理系统对p53抗原的表达进行定量分析，测定各组中p53蛋白表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内p53蛋白表达呈阴性，心先安预处理组心肌细胞内p53蛋白表

2、达呈阴性；假手术组心肌细胞内p53蛋白表达呈阴性，缺血再灌注损伤组p53蛋白表达呈阳性。图像分析结果显示，正常对照组、心先安预处理组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间p53蛋白的平均光密度和阳性面积率的差异有显著性意义（P<0.01）;正常对照组与假手术组之间、心先安预处理组与假手术组之间p53蛋白的平均光密度和阳性面积率的差异无显著性意义（P>0.05）。结论：心先安注射液预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌具有保护作用。【关键词】心先安缺血再灌注心肌p53蛋白　　随着社会老龄化和心血管疾病的高发，围术期恶性心血管意外已成为威胁手术病人生命的第一杀手，也严重影响了麻醉医生的工作安全。如何预防围术

3、期恶性心血管意外以及如何减轻缺血事件发生后心肌细胞的损伤，成为临床医生关心的焦点。心先安（即环磷腺苷葡胺注射液）是环化腺苷酸（cAMP）的衍生物，参与心肌细胞的能量代谢，提供外源性cAMP，对维持心肌细胞氧耗的供需平衡有积极意义，目前研究表明心先安预处理可减少缺血再灌注损伤心肌细胞的凋亡，具有一定保护意义。　　p53基因为一抑癌基因，目前研究表明p53基因与细胞凋亡有着密切关系，观察心肌细胞内p53蛋白的表达可以了解细胞受损程度。　　本实验采用免疫组织化学方法观察了心先安对缺血再灌注损伤心肌的保护作用，为缺血再灌注损伤心肌的治疗提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　选用健康雄性W

4、istar大鼠（SPF级）35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5mg·(100g)-1,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［呼吸频率60次·min-1,潮气量2ml·(100g)-1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成四组:正常对照组（不做任何处理）；假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）；缺血再灌注损伤组(IR)（缺血/再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml/kg，结扎左冠状动脉前降支45min,再灌注120min）；心先安注射液预处理组（在结扎前20min，静脉注射心先安注射液

5、0.8ml/kg,其它处理同缺血/再灌注组）。　　1.2主要试剂　　　心先安注射液（环磷腺苷葡胺注射液），江苏万邦生化医药股份公司。即用型兔抗鼠p53单克隆抗、即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸，以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司。　　1.3方法　　1.3.1常规HE染色　　1.3.2免疫组织化学S-P法检测p53相关抗原5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，p53均采用高压抗原修复，正常羊血清处理10min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合

6、物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为p53的阳性对照组。　　1.4免疫组织化学结果判断　　p53以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对p53抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。　　1.5统计学处理　　对各组免疫组织化

7、学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q检验，检验水准α为0.05。　　2结果　　2.1HE染色　　正常对照组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核位于细胞中央，细胞界限清晰，结构正常；假手术组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解，结构基本上正常；缺血再灌注损伤组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂；心先安预处理组：可见心肌细胞呈短圆柱