12第十二课特异性抗体制备技术

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1、第九章特异性抗体制备技术纯的理想的抗原免疫动物获得高效价、高特异性、高亲和力的抗体纯化和检测有关概念免疫原：指用于接种动物，使之产生抗体的抗原。第一抗体：用已知的免疫原接种于人或动物，机体会产生与之相应的、存在于血清中的抗体，这种抗体在实验中常称为第一抗体（简称一抗Ab1）。第二抗体：由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig接种动物或将动物Ig接种异种动物可制备出抗抗体，又称第二抗体(简称二抗Ab2）。抗血清：用免疫接种方法制备的含抗体血清习惯上称为抗血清（antiserum）也称免疫血清。例如：Ag→家兔→Ab1家

2、兔全血清（含Ab1）→绵羊→羊抗兔Ig（Ab2）Ag---Ab1---Ab2---Ab1第一节免疫原的制备一.细胞性抗原制备1.绵羊红细胞的制备:制备程序:绵羊颈静脉采血抗凝弃上清液无菌生理盐水洗3次弃去上清液用0.9%NaCl配成实验室所需浓度供使用。（2——5%）2000r/min5分每次2000r/min10分注意：红细胞洗涤次数不宜过多，以3次为宜，否则红细胞脆性增加，影响试验结果。如果用于制备溶血素的红细胞，应注意无菌操作。2.细菌细胞抗原的制备:制备程序:选择标准菌种在适宜条件下培养增殖以无菌生理盐水

3、刮取洗下菌苔革兰染色镜检，验证无杂菌以无菌生理盐水稀释至所需浓度加温杀灭（100C02—2.5h）无活菌试验合格后以生理盐水配成8—10亿/ml最后检查合格、封装、保存备用。二.可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原有:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、外毒素、核酸等。（一）组织匀浆的制备1.制备程序：新鲜或低温保存材料去包膜和结缔组织用含0.5%/LNaN3的生理盐水灌洗冷浴中洗净，剪成碎块细胞破碎处理组织匀浆3000r/min10分取上清液3000r/min10分使上清液澄清透明（即为提取可溶性抗原的材料）

4、。2.细胞破碎技术及评价:(1).酶处理法:常用的酶：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶。适用于:多种微生物细胞的破碎。优点是:作用条件温和，内含物成分不易破坏，细胞壁破坏程度可控制。(2).冻融法:原理：突然冷冻，胞内形成冰晶，及胞内外容积浓度的突然改变而破坏。方法：反复冻溶两次。适用于:组织细胞(3).超声破碎法:原理：超声波的机械振动而破坏。适用于:微生物和组织细胞。优点是:操作简单、重复性好、节省时间。(4).表面活性剂处理:常用的表面活性剂有:十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）二乙胺十六烷基溴（阳离子型）聚山梨酯

5、（非离子型)、新洁尔灭等原理：一定温度、PH、低离子强度条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使包膜的渗透压改变而溶解。优点是:作用温和适用于:破碎细菌、破碎细胞（提取核酸)（二）蛋白质抗原的处理要制备特异性高的抗血清，通常要纯化抗原，一般可采用以下方法：1.超速离心法：原理：利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到分离的目的。适用于：大分子抗原的分离，如：IgM、C1q也用于较轻的抗原物质，如：载脂蛋白A2.选择性沉淀法：原理：根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀

6、剂或改变某些条件，促使蛋白质抗原成分沉淀。从而达到纯化的目的。如：盐析是最常用的方法：优点是：简单方便。缺点是：纯度不高3.凝胶层析法：原理：利用分子筛作用对蛋白质进行分离。4.离子交换层析法：原理：利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白等电点不同，所带电荷量不同，与纤维素结合能力有差别。梯度洗脱，逐步增加洗脱液离子强度。5.亲和层析法：原理：是利用生物大分子的生物特异性，即生物大分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术。如：抗原和抗体、激素和受体、IgG和SPA优点是：纯度高、

7、简单快捷、成本贵。(三)核酸抗原的制备大分子量核酸具免疫原性制备的步骤是：破碎细胞核酸游离出来+酚+氯仿去除蛋白质乙醇沉淀核酸(四)类脂多糖抗原的制备G-菌细胞壁脂多糖即为类脂多糖常用苯酚法提取脂多糖（LPS)，方法是：菌液（加热）+本酚（加热）搅匀加热冰水急剧冷却至10C0离心分为两层，上层水层，下层酚层，菌体残渣于底部取水层（含LPS)透析除酚、浓缩、超速离心LPS位于上层沉淀的透明胶状部分绞出再悬于水中离心获纯化LPS。(五)IgG片段的制备1.酶裂解法：IgGFc+2FabFc段可用于制备抗重链血清。Ig

8、GF(ab)2+FcF(ab)2作为抗体试剂用于实验。2.氧化法和还原法：能将Ig轻重链分开，多用还原法。木瓜酶胃蛋白酶(五)IgG片段的制备1.酶裂解法：IgGFc+2FabFc段可用于制备抗重链血清。IgGF(ab)2+FcF(ab)2作为抗体试剂用于实验。2.氧化法和还原法：能将Ig轻重链分开，多用还原法。(六)纯化抗原的鉴定1.含量鉴定:可采用生化技术