mda gsh 蛋白方法--陈远华(修订)

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1、Beutler改良法测定组织GSH操作规程一、原理及意义原理：DTNB能被-SH基团还原，产生等克分子的2-硝基-5-巯基苯甲酸，而苯甲酸阴离子在一定PH值条件下呈黄色，在412nm波长下有吸收峰。意义：还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）是一种低分子自由基清除剂，它可清除O2˙、H2O2、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，能稳定含巯基的

2、酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤，最近还证明GSH也参与使VitE恢复到还原态的作用。GSH测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。二、器材可见光分光计、7ml离心管和管架、加样器和枪头三、试剂①1mmol/L的GSH（标准品）；②1％柠檬酸钠；③二硫双基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid,DTNB）试剂：用1％柠檬酸钠配成终浓度0.04％（w/v）；④20％三氯醋酸；⑤0.3mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）缓冲液。四、步骤1、样品处理及试验步骤（下面以肝脏组织为例）称取一定

3、量的肝脏组织于冰冷0.85％生理盐水中漂洗，滤纸吸干表面水分，烧杯内剪碎制备20%组织匀浆液（须用0.85％生理盐水或三蒸水）4000g离心10min后取上清液按上清液:20％三氯醋酸（体积比）为2:1混合（加TCA前留取20μl上清液用于Lowry法测蛋白）混匀，4000g离心10min（此步离心要充分，可适当提高离心力）收集上清液按表2测定。92、按下表1绘制标准曲线（单位：ml）表1GSH标准曲线的测定GSH（μmol/L）010203040501mmol/L的GSH00.050.10.150.20.25三蒸水0.

4、50.450.40.350.30.25磷酸盐缓冲液4.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.50.50.50.50.50.5混匀，5min内于412nm比色，以三蒸水调零，以标准GSH浓度为X轴，相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线，并求回归方程。3、按下表2操作测定样品GSH（单位：ml）表2Beutler改良法样品测定操作试剂测定管空白管待测样品液0.10磷酸盐缓冲液4.44.4DTNB试剂0.50.5三蒸水00.1测得的吸光值代入回归方程，可计算出样品液的GSH浓度。一、实验结果1、标准曲线结果GSH浓度（μm

5、ol）00.050.10.150.20.25A值0.0000.1260.2600.3940.5290.666根据上数据测得标准曲线方程为：X(μmol)=0.3744898Y+0.0017227（其中Y为吸光值，标准曲线看Figure1）9Figure1GSH标准曲线图一、注意事项①样品应冰上匀浆，所有步骤尽量保证低温下操作，否则结果偏低；②所有用水均需三蒸水，否则结果偏低；③未经蛋白变性处理的样品在－20℃不宜存放；④反应管内最终PH值必须保证在8.0～9.0间，否则结果不稳定；⑤配好的DTNB应在有限期内使用（4℃下

6、可存1个月）；⑥GSH浓度低时显色快，消退也快；浓度高时显色慢，消退也慢，一般反应1～5min后测定（最好不要超过5min）；⑦反应总体积可调为2.5ml。1.《自由基医学研究方法》中“Beutler改良法”。2.BeutlerE,DuronO,KellyBM.Improvedmethodforthedeterminationofbloodglutathione[J].JLab.Clin.Med.1963,61:882-890.（陈远华）9组织MDA测定操作规程一、原理与意义原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（Malon

7、dialdehyde,MDA）可与硫代巴比妥酸（Thiobarbituricacid,TBA）缩合，形成红色产物硫代巴比妥酸反应物（Thiobarbituricacid-reactivesubstance,TBARS），在532nm处有最大吸收峰。意义：机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，使组织细胞受损伤，并由此形成脂质过氧化物，如：MDA等。MDA的高低间接反应机体细胞的氧化损伤程度。二、仪器可见光分光光度计，95℃水浴锅（或普通铝锅开盖煮沸），低速离心机。7ml

8、塑料试管。三、试剂试剂盒组成配置如下（50T和100T）：50T试剂盒组成与配制：①试剂一：液体10ml×1瓶，室温保存。（缓冲液，天冷时会凝固，每次使用前应37℃水浴适当加温，直至透明）；②试剂二：液体6ml×1瓶，用时加170ml双蒸水混匀，4℃冷藏；（缓冲液，勿接触皮肤）③试剂三：粉剂×1瓶，用时将粉剂加到90