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时间:2018-07-22
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1、Beutler改良法测定组织GSH操作规程一、原理及意义原理:DTNB能被-SH基团还原,产生等克分子的2-硝基-5-巯基苯甲酸,而苯甲酸阴离子在一定PH值条件下呈黄色,在412nm波长下有吸收峰。意义:还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)是一种低分子自由基清除剂,它可清除O2˙、H2O2、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽,是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物,并且是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)两种酶类的底物,为这二种酶分解氢过氧化物所必需,能稳定含巯基的
2、酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤,最近还证明GSH也参与使VitE恢复到还原态的作用。GSH测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。二、器材可见光分光计、7ml离心管和管架、加样器和枪头三、试剂①1mmol/L的GSH(标准品);②1%柠檬酸钠;③二硫双基苯甲酸(dithio-bis-nitrobenzoicacid,DTNB)试剂:用1%柠檬酸钠配成终浓度0.04%(w/v);④20%三氯醋酸;⑤0.3mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)缓冲液。四、步骤1、样品处理及试验步骤(下面以肝脏组织为例)称取一定
3、量的肝脏组织于冰冷0.85%生理盐水中漂洗,滤纸吸干表面水分,烧杯内剪碎制备20%组织匀浆液(须用0.85%生理盐水或三蒸水)4000g离心10min后取上清液按上清液:20%三氯醋酸(体积比)为2:1混合(加TCA前留取20μl上清液用于Lowry法测蛋白)混匀,4000g离心10min(此步离心要充分,可适当提高离心力)收集上清液按表2测定。92、按下表1绘制标准曲线(单位:ml)表1GSH标准曲线的测定GSH(μmol/L)010203040501mmol/L的GSH00.050.10.150.20.25三蒸水0.
4、50.450.40.350.30.25磷酸盐缓冲液4.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.50.50.50.50.50.5混匀,5min内于412nm比色,以三蒸水调零,以标准GSH浓度为X轴,相应吸光值为Y轴,绘制标准曲线,并求回归方程。3、按下表2操作测定样品GSH(单位:ml)表2Beutler改良法样品测定操作试剂测定管空白管待测样品液0.10磷酸盐缓冲液4.44.4DTNB试剂0.50.5三蒸水00.1测得的吸光值代入回归方程,可计算出样品液的GSH浓度。一、实验结果1、标准曲线结果GSH浓度(μm
5、ol)00.050.10.150.20.25A值0.0000.1260.2600.3940.5290.666根据上数据测得标准曲线方程为:X(μmol)=0.3744898Y+0.0017227(其中Y为吸光值,标准曲线看Figure1)9Figure1GSH标准曲线图一、注意事项①样品应冰上匀浆,所有步骤尽量保证低温下操作,否则结果偏低;②所有用水均需三蒸水,否则结果偏低;③未经蛋白变性处理的样品在-20℃不宜存放;④反应管内最终PH值必须保证在8.0~9.0间,否则结果不稳定;⑤配好的DTNB应在有限期内使用(4℃下
6、可存1个月);⑥GSH浓度低时显色快,消退也快;浓度高时显色慢,消退也慢,一般反应1~5min后测定(最好不要超过5min);⑦反应总体积可调为2.5ml。1.《自由基医学研究方法》中“Beutler改良法”。2.BeutlerE,DuronO,KellyBM.Improvedmethodforthedeterminationofbloodglutathione[J].JLab.Clin.Med.1963,61:882-890.(陈远华)9组织MDA测定操作规程一、原理与意义原理:过氧化脂质降解产物中的丙二醛(Malon
7、dialdehyde,MDA)可与硫代巴比妥酸(Thiobarbituricacid,TBA)缩合,形成红色产物硫代巴比妥酸反应物(Thiobarbituricacid-reactivesubstance,TBARS),在532nm处有最大吸收峰。意义:机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基,后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用,使组织细胞受损伤,并由此形成脂质过氧化物,如:MDA等。MDA的高低间接反应机体细胞的氧化损伤程度。二、仪器可见光分光光度计,95℃水浴锅(或普通铝锅开盖煮沸),低速离心机。7ml
8、塑料试管。三、试剂试剂盒组成配置如下(50T和100T):50T试剂盒组成与配制:①试剂一:液体10ml×1瓶,室温保存。(缓冲液,天冷时会凝固,每次使用前应37℃水浴适当加温,直至透明);②试剂二:液体6ml×1瓶,用时加170ml双蒸水混匀,4℃冷藏;(缓冲液,勿接触皮肤)③试剂三:粉剂×1瓶,用时将粉剂加到90
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