培养基灭菌的目的和要求

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1、培养基灭菌的目的和要求目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。要求：达到要求的无菌程度(杂菌污染降低到被处理的每1000罐中只残留1个活菌的程度,10-3个/罐）；尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破坏是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。灭菌的方法化学法化学药品灭菌法：甲醛、苯酚等物理法干热灭菌法湿热灭菌法（生物工程工业常用方法）射线灭菌法1.湿热灭菌原理和影响灭菌的因素湿热灭菌的原理：主要是因高温使微生物体内的

2、一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。致死温度与致死时间：杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻和相对热阻：前者是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。后者是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。各种微生物对湿热的相对热阻微生物相对热阻营养细胞和酵母1.0细菌芽孢3×106霉菌孢子2~10病毒和噬菌体1~5某些微生物的相对热阻灭

3、菌方式大肠杆菌霉菌孢子细菌芽孢噬菌体或病毒干热灭菌12-1010001湿热灭菌12-103×1051-5苯酚11-21×10930甲醛12-102502紫外线15-1002-55-10湿热灭菌的优点蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。1.1湿热灭菌的理论基础将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。灭菌温度和时间的确定取决于：杂菌孢子的热灭死动力学反应器的形式和操作方式培养基中有效成分受热破坏的可

4、接受范围微生物的热死灭动力学方程：对数残留定律微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：N-任一时刻的活细菌浓度，个/L；t-时间，min；K-比热死速率常数，min-1，越小越耐热细菌孢子的热死灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。但当温度超过120˚C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。取边界条件t0=0，N=N0，对上式积分得或为理论灭菌时间的对数残留规律公式。问题：能不能做到绝对无菌？温度对K的影响微生物的热死灭

5、动力学接近一级反应动力学，它的比热死灭速率常数K与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征A-频率因子，min-1ΔE-活化能，J/molR-通用气体常数，J/（mol.k）活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件相同时，ΔE越高，K越低，热死速率越慢。∆E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量，值越大，表明微生物死亡速率随温度的变化越敏感，在灭菌中∆E/R是很重要的常数。不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。对（4）两边取对数，得微生物死亡速度常数K与温度的关系K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与有关，对

6、（5）两边对T的导数，得由该式可得出结论：反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而某些有效成分热破坏反应的ΔE较低。将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少物质ΔE（J/mol）维生素B1296232维生素B1盐酸盐92048嗜热脂肪芽孢杆菌孢子283257肉毒梭菌孢子343088枯草杆菌孢子317984孢子热死灭和营养成分

7、破坏活化能ΔEBS=67000×4.184（J/mol）ΔEVB=22000×4.184（J/mol）将灭菌温度从105˚C提高到127˚CKVB从0.02（min-1）提高到0.06（min-1）KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min-1）嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素B1的lnK-1/T图绝对温度倒数，1/T（·K）×10-32.12.22.32.42.52.62.72.8嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响灭菌温度（˚C）达到灭菌程度的时间（min）

8、维生素B1的损失（%）10084399.9911075891207.6271300.851101400.10731500.01511.2影响灭菌的因素培养基成分培养基的物理状态培养基中氢离子浓度培养基中微生物数量微生物细胞含水量微生物细胞菌龄微生物的耐热性空气排出情况搅拌泡沫1、培养基成分培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，微生物的热死亡速率越慢在热死温度