实验常用培养基、方法

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1、常用培养基LB培养基配方Typtone1%Yeastextract0.5%NaCl1%Amp选择培养基加量：50µg/mLAmp。YPD培养基配方Typtone2%Yeastextract1%D-glucose2%半乳糖培养基Typtone2%Yeastextract1%D-galactose2%抗性培养基抗生素加量：G418：350μg/ml；Zeocin：150μg/ml5-FOA培养基的配置（100mL）①50mL5-FOA-YNB培养基（过滤除菌）50mL5-FOA125mgUra5mgYNB170mg硫酸铵0.5g脯氨酸100mg葡萄糖

2、2gH2O50mL②50mL琼脂溶液（高压灭菌）称取2.0g琼脂粉，加入50mL水，高压灭菌。常用实验方法酵母电转化方法：（1）酵母于YPD平板上活化后，接种3mLYPD液体培养基，30℃200r/min培养8h左右。（2）取0.1mL种子液转接至30mL新鲜的YPD液体培养基，30℃100r/min继续培养10h左右，至菌液OD600在1.2~1.5之间。（3）6000r/min4℃离心5min收集菌体，用20mL无菌水离心洗涤菌体1次。（4）用15~20mLDTT溶液重悬菌体，30℃水浴放置60min，6000r/min4℃离心5min收集菌

3、体。（5）用20mL4℃预冷的1M山梨醇溶液重悬菌体，6000r/min4℃离心5min洗涤菌体。（6）重复步骤（5）三次，共四次。（7）用1mL1M山梨醇重悬菌体，转移至1.5mL离心管，离心后收集菌体，加入与菌体近似等体积的1M山梨醇重悬菌体。（8）每个转化取80μL菌液，加入10μL转化片段或质粒，20μL鲑鱼精DNA，混匀后转入电击杯，冰上放置5min后，1.5kv电击。（9）加入0.9mL含山梨醇的YPD培养基将电转液洗出，30℃100r/min复苏2h。（10）将菌液离心后弃上清，用1M山梨醇洗涤一次，用与菌体近似等体积的1M山梨醇重

4、悬菌体，取100μL菌液涂布选择性培养基平板，30℃培养至菌落长出。酵母基因组快速分离方法：（1）取1mL30℃，200rpm过夜活化的菌液，10000rpm离心1min，弃上清；（2）0.5mL无菌水重悬菌体，离心弃上清；（3）加入0.2mL破菌缓冲液，与菌体等体积的玻璃珠和0.2mL酚/氯仿，涡旋振荡5min；（4）加入0.2mLTEBuffer，快速振荡，高速离心5min；（5）吸取上清转移至新的离心管，加入0.2mL酚/氯仿，重复抽提至无中间沉淀相；（6）加入1mL无水乙醇，颠倒混匀；（7）12000rpm离心5min，弃上清，沉淀用50

5、μLTE缓冲液或水溶解；T克隆实验安排表T-cloningexperimentsschedule实验内容1）将大肠杆菌JM109接入LB液体培养基中，180r/min，37℃培养过夜（10h）2）按1:100的比例将培养一天的大肠杆菌接入另一个LB液体培养基中，180r/min，37℃培养2-3h3）取1mL菌液于1.5mL离心管中，冰浴15min，10000r/min，4℃，离心1min4）去掉上清液，加入1000µL0.1mol/LCaCl2，用移液枪将菌体吹起混匀，冰浴15min后，10000r/min，4℃，离心1min5）重复步骤4的操

6、作6）去掉上清液，加入100µL0.1mol/LCaCl2，用移液枪将菌体吹起混匀，冰浴，第二天备用7）在微量离心管中配制下列溶液，全量为5µLpMD18-TSimpleVector0.5µLPCR产物4.5µL（提前将PCR实验完成，）8）加入5µL的SolutionⅠ9）16℃水浴锅反应4h-16h10）将微量离心管中反应结束的溶液加入至100µLJM109感受态细胞中，冰浴30min11）42℃加热90s，再冰浴3-5min12）加入890µLLB液体培养基，37℃,150r/min振荡培养1h13）培养结束后，10000r/min离心1m

7、in，倒掉大部分上清液，剩余100-200µL悬浮菌液，涂布在含有Amp(终浓度50µg/mL,母液0.05g/mL)的LB固体培养基上，37℃培养箱12h左右14）将转化后平板上长出的白色单菌落接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养15）取培养3h的培养物1μL作为PCR反应的模板，PCR反应引物及反应程序见前所述16）PCR反应结束后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，排除其中的假阳性克隆17）送样至生工测序部，并备份保藏