家畜布鲁氏菌病血清学平板试验(pat)

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1、家畜布鲁氏菌病血清学平板试验（PAT） 一、应备有下列材料：1.受检血清：受检血清必须新鲜,无溶血现象、腐败现象、气味。2.在实验前血清必须置于温室中，使其达到20℃左右。3.抗原：由兽医生物药品厂生产供应。本抗原由加热杀死的布鲁氏菌菌体经染色制备而成的淡蓝色悬浮液。抗原本身出现凝集者应废弃。使用前应充分振荡，并使其温度达到20℃左右。4.阴、阳性血清：由兽医生物药品厂生产供应，本方法所用的阴、阳性血清与试管凝集试验法相同。二、操作方法：1.备一方形洁净的玻璃板：划成25个方格，横数5格，纵数5格，每格四平方公分，第一列各格写下血清号码。2.用0.2毫升灭菌吸管按下列剂量加受检血

2、清于任何一行（横格）的各格中：第一格0.08毫升，第二格0.04毫升，第三格0.02毫升，第四格0.01毫升。（如下表）血清号第一格第二格第三格第四格血清量（毫升）10.080.040.020.0120.080.040.020.0130.080.040.020.0140.080.040.020.01由于本试验所需血清量较少，因此，在操作过程中要求严格，应尽可能减少误差，最好滴出血清前用滤纸片擦去吸管表面沾附的血清。3.加平板反应抗原原液0.03毫升于上述各血清量中，并用牙签或细铁丝混匀，使抗原和血清推开，面积直径约2—3公分的圆形。由血清量最少的一格（即第四格）混起，每份血清用一

3、根牙签，用过的牙签要放固定容器中，工作完毕后集中烧毁。若用细铁丝作混合，每份血清混匀后应用酒精棉花擦净，然后再作另一份血清的混合。4.混合完毕，将玻璃板置于酒精灯火焰或凝集反应箱上，均匀加温，使达到30℃左右，并轻轻摇动玻板，使血清与抗原混合液呈缓慢的旋转运动，以保证充分混合。5—8分钟内记录反应结果。5.每次试验用1—2份已知阴性血清和1—2份阳性血清作平板凝集反应，以资对照。6.按下列标准用加号记录反应强度“＃”出现大的凝集片或小的颗粒物，液体完全透明，即100%凝集。“+++”有明显的凝集片，液体几乎全部透明，即75%凝集。“++”有可见的凝集片，液体不甚透明，即50%凝集

4、。“+”液体混浊，有仅仅可以看出的粒状物，即25%凝集。“—”液体均匀混浊。7.平板凝集反应与试管凝集反应的关系：用兽医生物药品厂生产的平板抗原作平板凝集试验时，0.08毫升血清的反应相当于试管法中1：25血清稀释液的反应，0.04毫升的反应相当于1：50，0.02毫升的反应相当于1：100，0.01毫升的反应相当于1：200。三、结果判定在我国，牛、马和骆驼于0.02毫升的血清量，猪、山羊、绵羊和狗于0.04毫升的血清量，出现两个加号以上凝集现象时，被检血清判为阳性反应。牛、马和骆驼于0.04毫升血清量,猪、山羊、绵羊和狗于0.08毫升的血清量，出现两个加号以上凝集现象时，被检

5、血清判为可疑反应。可疑反应的牲畜，经3—4周，须重新采血检验。牛和羊，如果重检时仍为可疑，可以判定为阳性，猪和马重检时，如果凝集价仍然保持可疑反应水平，而农场中的牲畜没有布病临床症状和没有大批阳性反应的患畜出现，该畜血清判定为阴性。附：虎红平板凝集试验（RBPT）1.虎红平板试验的特点布鲁氏菌虎红抗原是酸性和具有缓冲作用的染色抗原，虎红平板试验能揭露猪、牛、羊、鹿布鲁氏菌病患病机体血清中的特异性IgG1亚类抗体。但也有人提出对IgG2和IgM抗体敏感性较高，椐国外资料报导，该试验与常规试管凝集反应试验相比，能较早地检出患病动物，目前为止，国内和国外的资料证明，虎红平板试验与补体结

6、合试验结果较为接近。该试验操作简便，不需要复杂的设备，并且能迅速获得结果，适用于田间试验和筛选诊断之用。虎红平板试验判定方便，具有阳性结果的样品须进一步作补体结合试验或其它辅助试验。这样做既可节省劳力又可节省时间和得出较为正确的诊断结果。2.在进行虎红平板试验前，应将抗原和受检血清放置室温30—60分钟。准备一块洁净的玻璃板，用蜡笔划成四平方厘米的方格，每格中滴一份受检血清0.03毫升。吸取抗原（抗原在吸取前应反复倒转抗原瓶并摇动，使抗原均匀悬浮）。在每一方格的血清样品旁滴0.03毫升，每份血清用一根牙签搅动使血清和抗原均匀混合，使抗原和血清摊开成呈圆形直径约2—3厘米。于4分钟

7、内判定结果。出现凝集现象就判为阳性反应，否则判为阴性。吸取抗原和血清最好采用0.2毫升吸管，或选择每滴正好0.03毫升的毛细滴管。如果吸管数量有限,用过的吸管应至少连续通过三个盛有生理盐水的杯子冲洗。虎红抗原应置于4—15℃冰箱中或冷暗处保存，不可结冻，从生产日期起有效期为一年。每次试验均须设有已知阴、阳性血清对照，只有在对照血清结果成立的前提下，受检血清的检验方可认为是可靠的。                 供稿人：淄博市临淄区动物疫病预防控制中心