微生物工业菌种与培养基

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1、微生物工业菌种与培养基菌种与种子扩大培养菌种：实现从原料→目的产物的关键生产效率、产品成本、产品质量※※★从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；★诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证；★基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开发的进程。※从自然界中分离菌种的一般过程采样预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定※选择育种方法时综合考虑的因素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(2)对这一特定菌种的遗传生化的认识程度(3)经济费用★如，对特定菌

2、种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术；★如，对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。※一些常用工业微生物★抗生素生产有关的微生物放线菌（链霉素真菌（青霉素、头孢等）四环素；红霉素等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源※氨基酸生产有关的微生物★氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单；★谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌；★其它氨基酸生产菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯

3、草芽孢杆菌。※食品工业微生物包括：酿造业，酶制剂等★食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。★α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌。2、工业微生物(菌种)的要求1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和大量合成目的产物----价值高2）能在要求不高、易控制的培养条件下迅速生长和发酵，发酵周期短。----可操作性强3）根据代谢调控要求选择高产菌株，如营养缺陷型菌株或调节突变型菌株4）菌种抗噬菌体能力强，以防止感染噬菌体而造成“倒罐”现象的发生

4、。5）菌种纯粹，不易退化，可保证发酵生产和产品质量的稳定性。----遗传稳定性强6）菌种非病原菌，不产生任何有害的物质和毒素，以保证产品的安全。----安全性强3、工业微生物菌种保藏技术（1）斜面保藏：3-6个月；（2）沙土管干燥保藏：2年；（3）液氮保藏：2-3年；（4）悬液保藏：常温或低温；（5）超低温保藏：1年以上；（6）冷冻干燥保藏：5-10年。※菌种保藏目的：保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生产性能。基本原理：根据菌种的生理生化特点，创造条件使菌种的代谢活动处于不活泼的状态。基本原则：选用

5、优良纯种和创造一个最有利于菌种休眠的环境。休眠环境：微生物生长繁殖和代谢受抑，不易突变的环境，一般要求低温、缺氧、缺营养、添加保护剂、干燥等。保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。方法温度保护剂保藏时间适用菌种定期移植低4℃低温无数月，短期各种微生物细胞温保藏法液氮超低-196~-150℃甘油或长期适用范围最广，温保藏法DMSO微生物、动物细胞甘油低温-80~-70℃甘油1年以上特别适用于基因保藏法（-18℃）工程

6、菌沙土保藏法室温或低温数年芽孢杆菌、放线菌、曲霉菌等麸皮保藏法20℃长期放线菌、霉菌等蒸馏水保藏法4~10℃较长时间酵母、真菌冷冻干燥保干燥后，4℃脱脂乳、蔗糖数年各种微生物细胞藏法左右低温避光处※最有效，适用范围最广，多数国家级菌种保藏单位常用★原则：慢冻快溶★原理：利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。1.将10%甘油或DMSO作为保护剂分装与安培瓶（or冻干管）中；2.将长有菌落的琼脂（or培养液）悬浮于已灭菌的保护剂中；3.熔封安培瓶口（or盖上冻干管的盖子）。☆以1min下降

7、1℃的速度降至-35℃，使瓶内悬浮液体冻结，然后将安培瓶置液氮罐（or液氮冰箱）中，于-130℃以下储藏；☆恢复培养时，从液氮中取出安培瓶（or冻干管），立即于38~40℃水浴中摇动，至瓶内冰全部融化，按常法进行培养。※在超低温冷藏柜（-70~-80℃）中保藏菌种的一般方法是：1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70-80℃超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／mi

8、n。一些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。低温冰箱超※冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的非常有效的方法之一。※冷冻干燥步骤：☆冻干样品的准备：准备菌种，与保护剂混合均匀，分装至安瓿管；☆预冻：2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右；☆冷冻干燥：8-20小时；☆真空封口及真空检验：安瓿管颈部用强火焰拉细熔封。氯化钴溶液检测真空度