工业微生物菌种的筛选

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1、第二章工业微生物菌种选育工业微生物育种的必要性发酵工业的目的是为人们提供各种各样的发酵产品，菌种的特性是发酵能否成功的关键，野生菌株不会积累过多的代谢产物，我们需要对野生菌株改造，使其符合人们的要求（高代谢产物及其它特性等）；这个过程就是育种。工业微生物育种方法自然选育诱变育种杂交育种基因工程育种工业微生物菌种的筛选步骤菌株的筛选通常分采样﹑富集﹑分离﹑筛选﹑产物鉴别等步骤.出发菌株采样向菌中保藏机构购买或索取向其它机构购买或索取从自然界采样从自然界采样从土壤中采样根据微生物特点采样从土壤中采样土壤有机质状况土壤酸碱度和植被状况

2、地理条件季节变化根据微生物的生理特点产纤维素酶产蛋白酶产淀粉酶,糖化酶以碳氢化合物为底物的菌种等采样方法出去表层5CM左右的土层,取5~25CM的土样10~15克(北方土壤干燥,可在10-30CM处取样),装入事先准备好的容器内,编号并记录地点﹑土壤质地﹑植被状况﹑取样时间及其它环境条件等.富集培养富集培养是根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,取样品少许加入培养基中,给目的微生物一个最适的生长环境,经过一定时间的培养,目的微生物在数量上占绝对优势,可有效地分离出所需要的菌株.富集培养方法富集培养主要根据微生物的碳﹑氮源﹑

3、PH﹑温度﹑需氧等生理因素加以控制.举例一:分离纤维素水解酶产生菌举例二:分离耐高渗透压的酵母分离纯化分离,包括稀释分离法和划线分离法组织分离法（常用于病变组织或特殊组织）控制营养和培养条件控制营养和培养条件控制培养基中的营养成份控制培养基的PH抑制不需要的菌类加温处理利用指示剂或呈色剂的生化反应等工业微生物的诱变育种微生物育种是建立在遗传和变异的基础上的,一个菌种生物合成代谢产物的产量和质量由遗传因素所决定.一个性能好的菌种只有在合适的条件下才能表现出来.因此诱变育种的包括诱变筛选和优化环境条件三个重要环节.人工诱变育种的目的

4、提高有效产物的产量.改善菌种特性提高产品质量.例如:孢子生长力强,产泡沫少,需氧量低,抗噬菌体,耐高温等.开发新品种.人工诱变育种的优点人工诱变育种能加速基因突变,可大大地提高突变株的数量.具有速度快﹑收效大﹑方法简单等优点.育种前准备工作了解菌落的特征以及和生产性能的关系了解产物的代谢途径.了解影响菌种发育的主要因素.建立一个准确﹑简便﹑快速检测突变株和产物的方法.研究最佳保藏条件.诱变育种方法与步骤出发菌株的选择.菌悬液制备.诱变剂选择.诱变处理方法.突变株纯化及分离.出发菌株的选择选择具有一定生产能力或某种特性的菌株作出发

5、菌株.选择纯种作出发菌株.选择菌株应考虑稳定性.采用多出发菌株.选择出发菌株的其它因素.出发菌株的纯化将液体培养物或从斜面移接菌体细胞到0.9%生理盐水中,按10倍稀释法,逐一稀释到10-6~10-5,从适当浓度的稀释管中吸取0.1毫升,于事先准备好的琼脂平板上均匀涂抹,培养后,挑取一定数量(30~50个)菌落,进一步培养鉴定,最后确定遗传性状稳定菌株供诱变处理.单孢子菌悬液制备菌悬液要求:对进行诱变的菌体要保持同步,同时又要处在最旺盛的对数期.菌悬液制备方法(细菌):把经过20~24小时培养的新鲜斜面,移到装有基本培养基的三角

6、瓶中,于370C振动培养到对数期(16~18小时).接着于60C培养1小时,使之同步生长.然后加入一定浓度的嘧啶和嘌呤继续培养20~60分钟.置于低温(约20C)10分钟.离心洗涤.用生理盐水或缓冲溶液制备菌悬液.诱变诱变剂的选择.诱变处理方式.突变株分离和筛选微生物通过诱变因子处理,群体中产生各种突变体,其中有正突变﹑负突变和稳定型.需经过分离筛选,逐个挑出.突变是随机不定向的,但筛选是定向的.筛选的条件决定选育方向.常规筛选程序第一次诱变:出发菌株→诱变→分离在平皿上→挑选菌落(200个)→初筛(1瓶/株)→选取50株→复筛

7、(3~5瓶/株)→选取3~5株(供下次做出发菌株).第二次诱变:取上述菌株4株→诱变→分离到平皿上→每株取100个菌落→初筛(1瓶/株)→复筛→选取3~5株供第三次诱变.筛选方法随机筛选:将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上,随机挑选菌落,逐个进行鉴定.其优点是不管种子或发酵条件如何,都能做到与大生产条件接近.缺点是效率低.平板菌落预选法:根据菌种及其代谢产物的特性,在平板上设计许多巧妙的筛选方法和活性粗测方法.平板菌落预选法根据形态变异根据产物特性浓度梯度法摇瓶液体培养初筛:固定筛选条件,测定每一突变株,选出生产能力高的菌株.复

8、筛:对同一菌株采用不同的条件实验,选出生产能力强的菌株和相对应的实验条件.产物活性测定