间充质干细胞的分离及其类髓核细胞分化导向

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1、精选公文范文管理资料间充质干细胞的分离及其类髓核细胞分化导向　　间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是来源于中胚层的未分化的发育早期细胞，具有较强的增殖能力和多向分化能力。在特定的内环境和一定的细胞因子的诱导作用下，其可定向分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、成纤维细胞等，正是由于其所具有的特性，使其成为了组织工程学中最常用的种子细胞。　　由于骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,[键入文字][

2、键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料BMSCs）具有取材方便、体外培养简单、繁殖能力强、供体创伤小、不涉及伦理问题、良好的组织相容性、及其低抗原性所表现出的低免疫反应性等优点，使其成为了组织工程中经常使用的间充质干细胞。国内外均有使用一定的细胞因子诱导BMSCs增殖和分化为类软骨细胞及类髓核细胞的相关报道。本实验抽取新西兰兔的骨髓细胞，利用全骨髓贴壁法分离间充质干细胞，经过传代培养后再通过中胚层定向诱导分化的方法对所获取的细胞进行鉴定，确定其定向分化能力，再以转化生长因子3（TransformingGr

3、owthFactor-3,TGF-）和骨形态发生蛋白7（BoneMorphogeneticProtein-7,BMP-7）生长因子诱导其向类髓核细胞分化，为组织工程髓核的构建提供良好的种子细胞选择。　　1材料和方法　　1.1材料与试剂　　DMEM-LG培养基（Gibcol）、胎牛血清（Gibcol）、DMEM-HG培养基（Gibcol）、成骨诱导培养基（地塞米松10-9M，抗坏血酸钠0.2mM，-甘油磷酸钠10mM，5%FBS，DMEM-LG培养基，1%双抗溶液）、成软骨诱导培养基（地塞米松[键入文字][键入

4、文字][键入文字]精选公文范文管理资料10-7M，抗坏血酸钠0.2mM，丙酮酸钠1mM，转化生长因子-110ng/ml，ITS+LA，DMEM-HG培养基，2%FBS，1%双抗溶液）、成脂肪诱导培养基（地塞米松10-7M，吲哚美辛0.05mM，IBMX0.5mM，2%FBS，DMEM-HG培养基，1%双抗溶液）、茜素红S（Roche）、羊抗牛Ⅱ型胶原多克隆抗体（SouthernBiotechno-logy）、番红O（Sigma）、油红O（Sigma）、TGF-3（sigma）、BMP-7（sigma），CD2

5、9、CD105、CD166均购自eBioScience。新西兰兔购自上海生旺实验动物养殖有限公司。　　1.2兔BMSCs的分离培养　　取2月龄的新西兰大白兔，雌雄不限，戊巴比妥溶液腹腔麻醉后，常规备皮，消毒，严格无菌操作，以骨髓穿刺针接10ml注射器（注射器内含稀释的肝素钠3000U/0.2ml）自胫骨近端内侧处行骨髓穿刺术，抽取骨髓液3ml，缓慢注入预置4ml淋巴细胞分层液的离心管内，进行密度梯度离心。2000rpm[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料离心20分钟后，吸取中间的单个核细胞

6、层，弃去上清和脂肪，PBS（PhosphateBufferedSaline,磷酸盐缓冲液）缓冲液冲洗2次，再以1.6×104/cm2的浓度接种于100mm培养皿内，加入15mlHam’sF12培养液（含青霉素钠100U/ml，链霉素100g/ml，两性霉素B0.25g/ml)，加入胎牛血清终浓度为10%，置37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，于48小时后换液，以PBS冲洗3遍，去除全部非贴壁细胞，换上新鲜培养基，同样环境中继续培养。以后每3日换液一次，待原代培养细胞爬满培养瓶底时，即可进行传代。用0.2

7、5%的胰蛋白酶消化5分钟后，即可得兔原代骨髓间充质干细胞悬液。　　1.3兔BMSCs表面抗原的鉴定　　取生长汇合约90%的第3代细胞，小心吸去培养液，加入3ml0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液，于37℃消化约3分钟，加入含10%FBS的DMEM培养液1ml中止消化，PBS冲洗两次，以1000rpm离心5[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料分钟，弃去上清，加入新鲜培养液制备成细胞悬液，并调整细胞浓度为1×106/ml，取100l细胞悬液置于流式管中，按照试剂说明加入抗体，充分混匀后室温避光

8、放置30分钟，加入流式细胞仪缓冲液1ml混匀后1000rpm离心5分钟，弃去上清，再加入0.5ml流式细胞仪缓冲液重悬细胞后，以流式细胞仪进行检测。　　1.4兔BMSCs的诱导分化　　1.4.1向成骨细胞方向诱导分化　　取基本铺满瓶底的第3代细胞，胰蛋白酶消化后以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，加入成骨诱导培养液，每3天换液一次，培养14天后行茜素红S染色。　　1.4.2向成软骨细胞方向诱