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1、巴尔通体实验检测技术简介116O中国人兽共患病ChineseJournalofZoonoses2007,23(11)文章编号:1002—2694(2007)11—116O一03巴尔通体实验检测技术简介叶曦,姚美琳,李国伟中图分类号:R446.6文献标识码:A巴尔通体属(Bartonella)是一属由19种100多个变异体0病原体构成的微生物属群,其自然宿主主要是哺乳动物,包括猫,狗,啮齿动物,反刍动物也可分离出巴尔通体..能引起人类奥罗亚热,秘鲁疣,猫抓病,杆菌性血管瘤,战壕热,心内膜炎,视网膜炎,菌
2、血症等.由于巴尔通体的广泛致病性,引起了医学生物界的关注及重视.目前细菌的检测方法多采用细菌培养分离方法,聚合酶链反应(PCR),间接免疫荧光抗体测定法(IFA),各种方法优缺点各异,现综述如下.1巴尔通体的细胞培养与分离方法1.1巴尔通体细胞形态巴尔通体属细菌共同的特征是菌体较小,约0.3/xm×1.0/xm,最大不超过3.0/xm.呈革兰氏染色阴性,无抗酸性染色(non-acidfast),多形性杆菌(pleo—morphic),不易被碱性红染色,但容易被姬姆萨(Giemsa)或姬姆奈茨(Gime
3、nez)染色.巴尔通体在电子显微镜下呈球杆菌或"革履虫"状,菌有体毛,大多无鞭毛,少数有鞭毛,目前仅知B.bacilliformis(Weinman,1974)..和B.clarridgeiae(CourtesyofJamesA.carrol1)两种有鞭毛,细胞可呈球菌样,珠状,丝状或者排列成链状.图1所示为巴尔通体两种基本的细菌形态.^图1巴尔通体两种基本形态A电镜下带鞭毛的巴尔通r体;B电镜下不带鞭毛的巴尔通体1.2菌落形态巴尔通体菌落很小,直径在1～3ram之间,圆形,白色或灰白色,半透明或不透
4、明.刚培养的菌落附着在培养基上呈凹陷状,经几代体外培养后消失.菌落生长一段时间后或反复培养会发生变化,从干燥变为粘稠,细菌的抗原结构的变异由于初次分离培养巴尔通体要经过1～3w才能看到菌落生长,次代接种细菌生长较快2～5d就能看到菌落.".图2所示为兔血清培养基上的巴尔通体菌落.1.3分离培养方法从被感染生物体中分离到感染性的细菌是诊断细菌感染的"金标准".,对巴尔通体而言也不例外.分离标本可为血液,淋巴组织或淋巴液,皮肤组织及其器官,我们对鼠形动物血清标本分离巴尔通体的做法是.:取5O止全血加入20
5、0~L脑心浸液(BactoBrainHeartIn-图2含兔血清培养基上的巴尔通体菌落fusion)中按1:4稀释,取稀释液涂布于含5兔血脑心浸液琼脂平板(BrainHeartInfusionAgarDIFCO),于二氧化碳培养箱(NuairVSAUTOFLOWCO2Watetr-jackectedincabator,NV-4850型)5CO2,36℃,RH85中培养.5兔血脑心浸液琼脂平板配好后需先置同等条件下温育48h,无菌生长方可使用,样本血清培养1～2w后,从培养基中可见一种为圆形突起,光滑或
6、粗糙,形态均匀,直径0.5～1.5mm的微小菌落,菌落数约i00～600个,菌落形态变异较大,且较大型与微小型菌落互为转化.可疑菌落经1～4代分化培养后,菌株用5O甘油脑心浸液于一26℃保存.纯化的病原体用BASO刘氏染色液染色后,在油镜下观察,可见微小的球杆菌,形态清晰,呈淡红色.1.4方法优缺点采用病原学的方法技术较为简单通用,在巴尔通体分离培养上无需特殊培养基或设备,因此,应用很广泛.但需时间长,且巴尔通体感染的临床表现复杂多样细菌无特异表型存在鉴定困难等问题,也有它的局限性.2巴尔通体的聚合酶
7、链反应(PCR)技术2.1PCR技术在巴尔通体检测中的应用随着分子生物学的快速发展,越来越多的核酸检测方法应用于病原体检测.PCR是鉴定巴尔通体敏感和特异的工具,它可以检测人兽宿主标本中"非培养"的病原体,也能对分离培养的可疑细菌进行鉴定0.通常使用PCR扩增疑似巴尔通体部分或全部的16SrDNA基因,对16SrDNA的PCR产物测序,并与GenBank中已知的16SrDNA序列进行比对才能确定鉴定结果.1990年Relmenc等设计了第一份检测巴尔通体DNA的引物,对16"SrDNA基因的296bp
8、片段进行扩增,该片段和4个高度易变的核苷酸,可用于对巴尔通体的一些种类的区分.而后,Anderson0.等将方法加以改进发展.Regnery等对枸橼酸合酶基因(gltA)进行扩增,检测巴尔通作者单位:厦门市海沧区疾病预防控制中心,厦门361026;Email:yx6053366@163.corn2007,23(11)中国人兽共患病ChineseJournalofZoonoses1161体,实验证明对gltA基因的扩增为巴尔通体检测提供了一个方便,快速的方
