乌头碱体内代谢产物分析方法的研究

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1、乌头碱体内代谢产物分析方法的研究项目完成人员：马辰李慧义李文东刘爱茹李农项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心摘要运用体内与体外代谢的方法对乌头碱的代谢转化作了研究，体外代谢运用大鼠肝微粒体体外温孵法，优化了温孵体系，建立了反相HPLC-DAD分离检测乌头碱及其体外代谢产物的分析方法；体内代谢运用对大鼠灌胃给药，收集0-8h、8-24h、24-48h三个时段的尿液，通过冷冻干燥有机溶剂提取的前处理方法，HPLC-DAD检测，建立了体内乌头碱的分析方法，确定了乌头碱一标志性的代谢产物，LC-MS分析初步确定其结构，同时对乌头碱水解产物及不稳定性产物作了研究，通过LC-MS分析，其

2、水解产物为乌头碱8位酯键水解产物与乌头胺，不稳定性产物为8位的乙酰氧基结合一个氢掉一个乙酸基的产物。应用所建立的方法，对血、尿中乌头碱的分布进行了测定。一．乌头碱液相色谱条件的建立与血尿中的分布乌头碱、次乌头碱及其代谢产物的分子中均含有N原子，有较大极性，在分离中要考虑其结构特性。复方中的成分复杂，为了获得乌头碱与次乌头碱及其它组分的分离，曾选用乙腈-水-三乙胺系统，乙腈对被测组分的洗脱力强，出峰快，分离不好。甲醇-水-三乙胺系统，使化合物之间及与杂质有理想的分离效果。对于碱性化合物来说，流动相的pH值对分离效果的影响很大。为此考察了0.05%，0.04%，0.02%的三乙胺对分离的

3、影响，确定0.04%三乙胺可以满足乌头碱、次乌头碱与杂质峰的分离，且得到较好的峰形。使用的流动相为弱碱性，对色谱柱的破坏较大，因此采用流动相中加入少量酸，经比较，在100ml流动相中加入0.5ml冰醋酸时，可使分离达到目的，并使流动相的pH值在色谱柱的适合范围内。根据以上条件的考察，确定甲醇：0.04%三乙胺：冰醋酸（60：40：0.5）为流动相，测定复方酒剂中乌头碱与次乌头碱的含量。乌头碱与次乌头碱乙醇溶液的紫外吸收光谱表明，二者的最大吸收峰均为240nm。因此，选择240nm作为检测波长。大鼠口服给药，取血清，用3％高氯酸溶液超声提取3次后，冷冻干燥后，用乙酸乙酯提取3次，蒸干，

4、用甲醇溶解，液相色谱测定，给药3h，血清中乌头碱含量为1.3mg/mL，第二天取血，未检测到乌头碱。给药后收集24h尿液，冷冻干燥后，用乙酸乙酯提取316次，蒸干，用甲醇溶解，液相色谱测定，尿中的乌头碱达15.1mg/mL，24－48h尿液降为1.1mg/mL。测定结果表明，血中乌头碱很快检测不到，且其浓度较尿中浓度低，因此尿中鉴定乌头碱中毒更有实际意义。二．乌头碱水解产物及不稳定性产物研究1.试剂的配制乌头碱标准溶液：精密称取1mg乌头碱，置5mL容量瓶中，用MeOH定容；精密称量1mg乌头碱，置5mL容量瓶中，用H2O溶解（不能完全溶解）。水解样品的配制：取2mg乌头碱对照品，加

5、甲醇0.5mg/mL的溶液；取此溶液2mL,加一滴稀盐酸；同样取2mL，不加稀盐酸。取2mL乌头碱对照品水溶液（0.5mg/mL），加一滴稀盐酸，同样取2mL乌头碱对照品水溶液（0.5mg/mL）不加稀盐酸。将这四个样品于沸水浴中3h，充分水解。取2mL乌头碱对照品水溶液（0.5mg/mL），加适量MeOH使不溶物溶解。将该样品于37℃水浴1.5h后取出。2.水解样品的HPLC-DAD分析与LC-MS分析将水解完的样品进行HPLC-DAD分析，色谱条件同前，通过谱图有相关峰出现，又结合LC-MS测定结果进行分析，乌头碱甲醇溶液不加酸水解的HPLC色谱图，与原药乌头碱比较，其中tR为1

6、4.6min为乌头碱的色谱峰，tR为12.8min为乌头碱N去乙基水解产物，tR为9.0min为乌头碱8位酯键的水解产物，tR为5.6min为苯甲酸的色谱峰，该苯甲酸是由乌头碱的8位水解产物在14位进一步水解而掉下的一个苯甲酸，所得乌头胺不含有紫外吸收的官能团，紫外检测器检测不出，质谱图中可以体现。乌头碱标液（MeOH与H2O混溶）于37℃水解1.5h的HPLC-DAD色谱图，tR10.5min的色谱峰为乌头碱的不稳定性产物，通过其质谱图解析，初步其为乌头碱8位乙酰氧基与15位的氢结合掉一个乙酸基的产物。16以下为乌头碱水解产物及不稳定性产物结构示意图乌头胺乌头碱8位水解产物乌头碱不

7、稳定性产物乌头碱三．乌头碱体外代谢研究1.动物的诱导与肝微粒体的制备Wistar种大鼠，腹腔注射苯巴比妥生理盐水溶液60mg/kg，每天一次，连续三天按文献报道的二次离心法制备肝微粒体，用Lowry法测定蛋白含量。162.温孵体系的优化依据乌头碱的结构特点及已有的文献工作，设计了乌头碱的有氧大鼠肝微粒体体外温孵体系，该体系组成为：大鼠肝微粒体（Microsomeprotein）、NADP、NADH、G-6-PDH、G-6-P、Mg2+。大鼠肝微粒体体外温孵