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时间:2018-07-18
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1、苍山大蒜低聚糖纯化技术研究及分子质量测定摘要:本论文旨在建立苍山大蒜中低聚糖(GOS,Garlicoligosaccharide)的分离纯化技术,并测定其分子质量。分别研究了聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、有机溶剂沉淀法和葡聚糖凝胶色谱法对GOS的纯化效果。结果表明,聚酰胺色谱柱对大蒜粗糖中蛋白质的脱除率为66.8%,糖回收率为98.9%;经DEAE-纤维素(OH-)色谱柱、乙醇分级沉淀和SephadexG-25色谱柱纯化后,GOS的纯度为99.1%,数均分子质量为1770D,。关键词:大蒜;低聚糖;分离纯化大蒜营养丰富,在我国历来被视为药食两用的佳品。据报道,大蒜
2、有降血脂、抗菌消炎、抗肿瘤、保护肝脏和抗衰老等作用[1-3]。其中,大蒜中的糖类物质是蒜中的主要活性成分之一[4-8]。大蒜低聚糖属杂果聚糖[8-10],具有益生元的作用[11]。低聚果糖有双向调节人体肠道微生态的功能,且低聚果糖很难被人体消化吸收,是一种低能量的糖,不会引起肥胖。低聚果糖作为一种水溶性膳食纤维,能降低血清胆固醇和甘油三酯含量,所以低聚果糖也可作为高血压、糖尿病和肥胖症等患者使用的甜味剂[12]。由于大蒜产地和品种等不同,对经分离纯化得到的大蒜多糖性质的研究报道并不一致。苍山大蒜的外形较差,不宜作为商品直接出售。但苍山大蒜富含低聚糖,具有较高的开发
3、利用价值。本文旨在建立苍山大蒜低聚糖的分离纯化技术,并测定其分子质量,为大蒜低聚糖的进一步研究及应用提供基本方法。1.材料与方法1.1材料与试剂大蒜苍山大蒜;聚酰胺(30-60目)国药集团上海试剂公司;DE-52Whatman公司;SephadexG-25、蓝色葡聚糖-2000Pharmacia公司;果糖标准品Amresco公司;多糖标准品Fluka公司;其它试剂均为国产分析纯。1.2仪器与设备TDZ5-WS型离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司;IGJ0.5冷冻干燥机北京四环科学仪器厂;752型紫外可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司;BS-100A自动部分收集器
4、上海沪西分析仪器厂有限公司;高效液相色谱系统日本岛津公司;高效液相色谱柱奥秘BauloSB5-2546-c18-060C18柱(4.6mm×250mm,5μm)。1.3技术路线鲜蒜→高温灭酶→破碎→提取→沉淀→冻干→纯化1.4方法大蒜粗糖提取采用本实验室前期建立的方法[13]。1.4.1蛋白质脱除效果的比较研究Sevag法对蛋白质的脱除效果研究:称取10.0g粗糖干粉溶于100mL蒸馏水中,配成粗糖溶液,加入20mL的Sevag试剂(氯仿:正丁醇=5:1,V/V),剧烈振摇20min,静置30min,3000r/min离心15min,收集上清液,重复操作数次,至无
5、变性蛋白质出现为止。考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量[14],苯酚-硫酸法测定总糖含量[15],计算糖损失率和蛋白质脱除率。聚酰胺柱色谱法对蛋白质的脱除效果研究:取一定量的大蒜粗糖上样(φ2.5cm×34cm),蒸馏水洗脱,分别采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝G-250法测定洗脱液中的总糖和蛋白质含量。计算糖损失率和蛋白质脱除率。量取7mL聚酰胺装柱(φ1cm×20cm),2g粗糖上样,蒸馏水洗脱,至无糖洗出为止。测定洗脱液中蛋白含量,计算动态吸附容量。1.4.2大蒜低聚糖的DEAE-纤维素色谱柱法纯化经脱蛋白后的大蒜低聚糖1.5mL上样(f8mm×170mm),
6、上样浓度为5%(g/mL),梯度洗脱,流动相分别为:蒸馏水,0.05mol/LNaCl,0.10mol/LNaCl,0.15mol/LNaCl,0.20mol/LNaCl,0.25mol/LNaCl,0.20mol/LNaOH。自动部分收集器收集洗脱液(3min/管),共收集98管,苯酚-硫酸法测每管总糖含量,绘制洗脱曲线。收集主要组分,采用HPLC测定其分子质量分布。色谱条件为:GPC色谱柱:SB-802.5;流动相:三蒸水;流速:0.8mL/min;柱温:30℃;柱压:3.0MPa;示差折光检测器检测。1.4.3大蒜低聚糖的沉淀法分级纯化称取2.0g经DEAE
7、-纤维素色谱柱纯化得到的中性糖,溶于10mL蒸馏水。加10mL95%(V/V)乙醇,4℃静置2h,3500r/min离心15min,收集沉淀(记作沉淀1),上清液继续加10mL95%(V/V)乙醇,收集沉淀2,重复上述步骤8次,最后一次醇沉后,上清液水浴挥干,收集干物质。HPLC测定不同沉淀组分的分子质量分布(方法同1.4.2)。1.4.4大蒜低聚糖的葡聚糖凝胶SephadexG-25色谱柱法纯化取分级沉淀5至8的合并样品10mg溶解上样(f12mm´300mm),蒸馏水洗脱,流速5d/min,自动部分收集器收集(7min/管),测定洗脱液中总糖含量,绘制洗脱曲线
8、,收集主峰
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