血红蛋白电泳检查(电泳法)

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1、血红蛋白电泳检查（电泳法）1.原理           血红蛋白是由两对多肽链组成的复杂分子。每一条链含有血红素和络合铁原子的卜啉。所有血红蛋白的血红素部分都是相同的。所测定的血红蛋白的蛋白部分称之为珠蛋白。正常人血红蛋白多肽链包括α、β、δ和γ。血红蛋白的结构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基酸不同可形成不同的血红蛋白，其表面电荷不同，在电场中的泳动率不同。本实验在碱性（PH=8.60）条件下，以琼脂糖凝胶电泳的方法进行，对红细胞洗涤后造成溶血，电泳分离血红蛋白后以氨基黑染色。多余的染色液用酸性液体洗去。待琼脂糖凝胶板干燥后，肉眼可直接判别有无电泳条带异常。运用光

2、密度扫描仪检测准确定量分析电泳条带异常情况。血红蛋白异常有二种类型：血红蛋白性质或结构的异常称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红蛋白性质异常，称之为地中海贫血。2.标本采集2.1标本采集前病人准备：受检者应空腹。2.2标本种类：抗凝血2.3标本要求：抗凝剂选用EDTA，柠檬酸或肝素均可，避免碘乙酸。常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的干燥。清洁试管中，充分混匀。3.标本储存：储存于2-8℃冰箱中，5天。4.标本运输：储存于2-8℃状态下的冰壶或泡沫箱密封运输。5.标本拒收标准：细菌污染、溶血或脂血标本不能作测定。6.试剂6.1试

3、剂名称：血红蛋白电泳检查试剂6.2试剂生产厂家：法国Sebia公司6.3包装规格：150tests6.4试剂盒组成琼脂糖凝胶 10块                溶血素 1瓶缓冲液条带 10包×2条            薄滤纸 1×10张氨基黑（浓缩液）1瓶×100ml        点样模具滤纸 10条×1盒6.5试剂储存条件及有效期：贮存于室温（15～30℃）或冰箱（2～8℃），不能冷冻。有效期两年。7.仪器设备7.1仪器名称：SEBIA电泳仪7.2仪器厂家：法国Sebia公司7.3仪器型号：HYDRASYS8.操作步骤8.1血红蛋白液制作：抗凝血离心，5000rpm，5分

4、钟，去掉血浆，用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞3次，若红细胞体积小于10ul，需特别小心。取10ul红细胞加入130ul溶血液造成溶血。震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟待测。8.2启动电泳仪8.3将加样器放在一平板上，有数字的一端向上。各加样孔加入10ul溶血的样品，2分钟内加样完毕。将加样器放入保湿盒内，齿端向上（转运时用塑料齿保护架）。等待5分钟，使样品扩散至齿端。打开电泳仪盖，抬起电极和加样器支架。8.4使用HYDRAGEL15HEMOGLOBINCE时选择仪器的“HBTOTAL”程序（位于链盘左侧）。8.5从包装袋内取出缓冲条，拿出末端的塑料片，将缓冲条两端塑料片固定在电

5、极支架背侧的钉上，塑料片应紧贴支架。8.6取出凝胶板。将薄的滤纸轻轻吸去凝胶板表面的多余液体，然后立即丢弃滤纸。在电泳仪温度控制板表面的边线内加200ul蒸馏水或去离子水。凝胶面朝上，放置凝胶板，边缘对齐边线。略略将凝胶弯曲，然后放平，使水均匀分布在凝胶板下面而不含气泡。8.7降低支架，使缓冲条不接触到凝胶板。8.8从保温盒里取出加样器。取时拿保护框。折断加样器齿端保护框。将加样器放在4号位置。8.9关上电泳仪盖子，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始。8.10凝胶染色扫描8.10.1打开盖子8.10.2取出并丢弃加样器8.10.3升高两个支架，握住塑料端取出并丢弃缓冲

6、条。8.10.4打开凝胶托架，平放，将干燥的凝胶片放入两层间，然后关上托架。8.10.5将凝胶支架放入染色池8.10.6取出凝胶支架，打开盖子，取出干燥的凝胶片。8.10.7在光密度仪的570nm处或以黄色滤光片扫描测定。使用HYDRYS，DVSE或PREFERENCE光密度仪时，使A2片段的标记置于扫描板5mm的标志处。9.结果判断与参考范围      扫描得到的只是每种血红蛋白条带的相对浓度值。取出胶片后，首先清洁胶片的背面。判断溶血液的浓度是否合适，主要看基质带的浓度，如基质带浓度过淡，说明溶血液的浓度太淡。正常时A2浓度大约为基质带浓度的1-2倍。半岁-成人:HbA≧94.

7、5﹪,HbF﹤2.0％,HbA2﹤3.5％1个月：HbA12-40﹪,HbF60-93％,HbA20.1-1.0％6个月：HbA86-98﹪,HbF0.84-10.7％,HbA20.87-2.9％脐带血：HbA4-40﹪,HbF30-96％,HbA2﹤1.0％10.质量控制      建议测定每一批样本时都附有一控制品或含有血红蛋白A,F,C和S的血样本。11.临床意义11.1检测β-地中海贫血11.1.1轻型：HbA2轻度升高，大多在4％-8％11.1.2中间型：H