三,电泳法(electrophoresis)

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1、三、电泳法（electrophoresis）历史及应用分类（据原理）基本原理常用电泳法例举[全属于区带电泳（注意介质）]电泳法最早由瑞典的Tiselius于1937建立，用移界电泳法成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即白蛋白、α1-、α2-、β-、和γ-球蛋白。在药学领域，是生化药物和基因工程药物分析的重要手段。按分离原理分类移界电泳（movingboundaryEP）区带电泳(zoneEP)等速电泳(isotachophoresis)等电聚焦(isoelectricfocusing)不同电泳法的分离原理示意图AB+BABAABBAAB

2、CCBA移界区带ABC等速等电聚焦pH9876混合分立稳态时毗邻稳态时分立静止高效毛细管电泳（highperformancecapillaryelectrophores,HPCE）毛细管区带电泳毛细管等电聚焦……与一般电泳法的区别：使用了毛细管柱。极为高效。基本原理：在电场作用下,溶质因迁移率(泳动率)不同而达到分离.阻力:f=6пrηv(r为质点直径;η为介质粘度;v为迁移率)受力分析动力:F=EQ质荷比质点有效直径溶液粘度离子强度电渗现象影响因素离子氛现象：被分离的粒子（如蛋白），在离子强度大的体系中。离子氛现象明显。具相反电荷的粒子

3、阻碍了粒子的运动,朝相反方向运动.离子强度对电泳的影响离子强度+++++++++离子氛迁移率电渗现象对电泳的影响电渗：液体在电场中对固体支持物的相对移动固体------------+++++++++++++电渗方向介质原理特点纸电泳Paperelectrophoresis纸（纤维素）质荷比分辨率低醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素质荷比在纸电泳基础上的改进PAGE法聚丙烯酰胺凝胶质荷比+分子筛凝胶不仅作为支持物，且以分子筛主动参与样品的分离。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶分子筛用于测定蛋白质亚基的分子量琼脂糖凝胶电泳琼脂糖分子筛因孔径大，用于核

4、酸的研究醋酸纤维素较纸电泳的优点电渗现象影响小醋酸纤维素膜对蛋白的吸附小，几无“拖尾”。由于醋酸纤维素亲水性小，所容纳的缓冲液也较少，电流大部分是由样品传导，所以分离速度快。醋酸纤维素是纤维素（纸）的醋酸酯丙烯酰胺+N，N-甲叉双丙烯酰胺具三维空间凝胶网络聚合催化剂：过硫酸铵（AP）催化生成自由基加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）提供自由基为什么聚丙烯酰胺具有分子筛的作用？（不同的配比不同的孔径）SDS-PAGE与PAGE有什么区别呢？SDS（十二烷基磺酸钠）+蛋白线性复合物使复合物所带负电荷远超过天然蛋白本身电荷，消除了电荷效应，而分子

5、量占主导。琼脂琼脂糖琼脂胶脱去SO42-丙酮酸酯基应用由于孔径大，对大多数蛋白来说，其分子筛作用微不足道。因此广泛应用于核酸的研究，分离范围广（200bp-50kb的DNA）.PAGE圆盘电泳（discEP）不连续平板电泳（slabEP）连续样品胶（溶解样品）浓缩胶（无分子筛作用，浓缩样品）分离胶（主要分子筛兼有质荷比）discNotice:1.两化合物均是中枢神经系统毒物,避免吸入粉尘和接触皮肤。2.染色：一般用考马斯亮蓝R-250（595nm）若灵敏度要求高，用微量银染（灵敏度较前者大100倍）Steps:1.制胶2.上样3.电泳4.

6、染色Steps:1.loadedwithDNA2.beingrunbytheapplicationofanelectriccurrent3.Observation.ThesmallerthepieceofDNA,thefasteritrunsinthegel.4.observeunderultravioletlightwhenthecurrentisturnedoff.thegelisstainedwithethidiumbromide(EB).ResultNotice:溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手

7、套进行操作。勿将溶液洒在台面上，用后用水彻底冲洗干净四、生物检定法定义：利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。生物检定的应用范围药物效价测定1.理化方法不能测定含量2.虽可用理化方法测定，但理化测定不能反映临床生物活性或效价（如氨基苷类）微量生理活性物质的测定因浓度低，很难用理化方法测定（神经介质、激素等）注意点：只有当无适当理化方法时，才用生物检定法。它是理化检验的一个补充。原因由于生物差异的存在，生物检定结果误差较大，重现性比较差，需要控制的条件较多；测定费时，计算繁琐。谢谢！DNA-

8、19缺点：存在对流。成分相互重叠。定义:在一根U型管里的溶液中,各物质据泳动速率的不同,达到分离.移界电泳+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+