园林专业微生物学实验讲义

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1、微生物学实验讲义实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒一、实验目的了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基

2、本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。三、试剂与器材1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验内容1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→

3、加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌五、关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。2.调pH不要过头。3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。六、思考题1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?3.培养微生物的

4、培养基应具备哪些条件?为什么?4.培养基的配制原则是什么?实验二细菌形态观察及单染色一、实验目的1.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。2.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。3.巩固显微镜(油镜)的使用方法。4.初步认识细菌的形态特征。二、实验原理细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用

5、碱性染料进行简单染色。三、试剂与器材1.材料大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2.试剂吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。3.器材显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等。四、实验内容简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检五、关键步骤及注意事项1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。六、思考题1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环币?2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?3.如果你的涂片未经热固定，将会出现什么

6、问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢? 实验三放线菌及霉菌形态观察一、实验目的1.了解放线菌、霉菌形态观察的原理。2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。二、实验原理放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基

7、丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基

8、表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。三、试剂与器材1.材料黑曲霉、青霉和根霉，细黄