杜塘水库微囊藻的分离培养及生物学特征研究

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1、杜塘水库微囊藻的分离培养研究【摘要】以杜塘水库野生微囊藻为研究对象，利用毛细管法和等比稀释平板法成功的分离出微囊藻单株，初步鉴定为挪氏微囊藻（Microcystisnovacekii），研究表明其生长曲线符合典型的S型单细胞藻类生长曲线，细胞平均生长速率常数k为0.508，细胞平均倍增时间为47h。通过研究不同温度条件对该藻生长的影响表明温度是影响该微囊藻生长的重要因素，在2500lux，光暗比12h：12h时，随着温度的升高，该微囊藻的生长速率逐渐增大。低温（15℃）显著抑制微囊藻的增长，该微囊藻生长的最适温度为25～30℃。【关键词】温度；分离纯化；微囊藻水体富营养化对水资源利用造成了很大

2、危害，如自来水厂滤池的堵塞，藻类死亡产生恶臭，水体DO值下降，以及“水华”毒素引起动物中毒及饮用水安全等问题。因此，研究水体藻类生长的规律及“水华”形成的原因，寻求防治对策，已引起许多学者的重视。杜塘水库位于福建省漳州市云霄县境内，建成于1958年，水库集水区面积约为24.21km2，实际库容为1.27×107m3，水面面积约0.9km2，最大水深约30m，平均水深14m，是东山县及邻近的常山经济开发区等乡镇的主要饮用水源，年供水量约1.255×107m3，供水人口24.1万人。2007年9、10月份，杜塘水库发生大面积水华，水库表层水体呈现浓绿色，局部水面形成粘液状粘稠物质，直接威胁到当地居

3、民的生活饮用水安全，引起了省市有关部门的高度重视。杜塘水库藻类的优势种为微囊藻，其种类达6－7种，本研究对其中常见的一种微囊藻进行分离纯化培养，为研究微囊藻的分离纯化技术及生物学特征研究积累有用的资料。1实验材料与仪器1.1试剂90%丙酮PH7.550mMTris-HCl缓冲液BG11培养液：成分NaNO3K2HPO4·3H2OMgSO4·7H2OCaCl2·2H2OCitricAcidcombinedwithFerricAmmoniumCitrateEDTANa2CO3TraceMetalsolutionH3BO3MnCl2·H2OZnSO4·7H2ONa2MoO4·2H2OCuSO4·5H

4、2OCo(NO3)2·6H2O含量1.5g/L40mg/L75mg/L36mg/L6mg/L1mg/L20mg/L2.86mg/L1.81mg/L0.222mg/L0.079mg/L0.390mg/L0.0494mg/L1.2仪器海尔HRGZ-300A型光照培养箱HFSAFE-1200型生物安全柜NikonEclipseE200显微镜NikonDigitalsightDS-SMCameraUV-9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）L-550台式低速大容量离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）CRDX-280型不锈钢电热手提式灭菌消毒器（上海申安医疗器械厂）1.3试验藻种杜塘水库分离

5、的野生微囊藻2实验方法2.1微囊藻的分离纯化本实验采用毛细管法结合等比稀释平板法对杜塘水库中的微囊藻进行分离纯化。取25号浮游生物网捞取的水库水样，静置，取少量上浮藻类群体样品镜检，确认大部分为微囊藻属种类后，用吸管吸取少许上浮的藻类在200目筛绢上，用无菌水清洗过滤，除去其中混杂的单细胞藻，留下大部分的微囊藻群体，再在显微镜下用毛细管挑取微囊藻群体到无菌的BG11[1]原水混合液中培养（水库原水经过0.45μm滤膜抽滤，高温灭菌处理），作为分离培养的原始藻种。再采用等比稀释平板法：0.9%BG-11琼脂培养基、25℃，2500lux，光暗比12h：12h培养：数天后，挑选表面光滑、蓝绿色、直

6、径约1.5mm的圆形单藻落，放入装有10mL培养液的无菌小三角瓶内培养，生长1~2周后镜检观察。2.2微囊藻的形态特征观察及种的鉴定分离纯化的微囊藻种置于载玻片上观察并拍照，显微观察和拍照采用的设备为NikonEclipseE200型光学显微镜，外接NikonDigitalsightDS-SMCamera，与台式计算机相连拍照，数码拍照和细胞直径的测量通过其附带的软件NikonElementsF2.20(Build232)控制和实行。软件的图像测量前，用Olympus的物镜测微尺（每小格0.01μm）较正。根据其形态学特征进行种的初步鉴定。2.3微囊藻培养条件及生长曲线的测定　计数不同浓度梯度

7、的微囊藻培养液细胞个数（n）[2]，同时在665nm处测定相应的吸光值，将二者的值做标准曲线。取分离好的微囊藻培养液接入250mL三角瓶，内装100mLBG11培养液，25℃，2500lux，光暗比12h：12h，每日固定时间测定OD665nm值。以天数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线。细胞平均生长速率常数公式：k=[3.322/(n-1)]·lg(An/A1)，k为藻细胞平均生长速率常数，