辛伐他汀、阿托伐他汀对脑缺血再灌注大鼠血清mda、sod及脑组织nos表达的影响

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1、遵义医学院２００６届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后ＮＯＳ等的影响材料和方法一实验材料１．１实验动物Ｗｉｓｔａｒ大鼠３６只，雌性，体重２００—２５０ｒａｇ，购于第三军医大学野战医院动物研究所，清洁级，动物中心许可证号：渝实动设旌准第２６０号。饲养条件：室温２２～２８℃，相对湿度４０％－一７０％，每日１２ｈ光照维持，昼夜循环，饲以蛋白质含量为２１％的标准饲料块，自由饮水，分笼饲养。１．２主要试剂辛伐他汀片阿托伐他汀钙片ＮＯＳ试剂盒ＭＤＡ检测试剂盒ＳＯＤ检测试剂盒ＰＢＳ液多聚赖氨酸其他生化试剂１

2、．３主要仪器及设备７２１分光光度计电子天平台式高速离心机海南海灵制药厂有限公司北京红惠生物制药股份有限公司福建福州迈新生物科技公司购自南京建成生物科技公司购自南京建成生物科技公司武汉ＢｏＳＴＥＲ公司武汉博士德公司产品均为国产分析纯上海生化仪器厂北京赛多利斯电子有限公司产品ＥＢＡ２１，Ｈｅｔｔｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ－８０Ｕ低温冰箱ＦｏｒｍａＳｃｉｅｎｔｉｃ德国光学显微镜微波炉（７００ｗ）Ｎｉｋｏｎ显微照相机重庆光学仪器厂日本ＮａｔｉｏｎａｌＩＥＣ７０５日本Ｎｉｋｏｎ公司二实验方法２．１实验分组Ｗｉ

3、ｓｔａｒ大鼠适应性喂养１ｗ，经筛选，３６只Ｗｉｓｔａｒ大鼠按抓取的随机分为６组：假手术组（Ｓｈａｍ），辛伐他汀预处理组（Ｓｉｍ，其又分为高剂量组和低剂量组），阿托伐他汀预处理组（Ａｔｏｒ，亦又分为高剂量组和低剂量组），缺血再灌注组（ＩＲ组），每组６只。术中出血较多、出现呼吸困难、６遵义医学院２００６届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后ＮＯＳ等的影响取脑时发现蛛网膜下腔出血及提前死亡者剔除，并补足相应例数。２．２给药方法辛伐他汀和阿托伐他汀小剂量组均以１．５ｍｇ／ｋｇ．ｄ计算，用生理盐水配成０．

4、３ｍｇ／ｍｌ浑悬液，大剂量组均以６ｍｇ／ｋｇ．ｄ计算，用生理盐水配成１．２珊ｇ／ｍｚ，根据计算的量以灌胃针灌胃，每天一次，共７天。假手术组与ＩＲ组均以等量生理盐水灌胃。药物剂量的计算根据动物实验方法学中公式：Ｄｂ＝Ｄａ＊Ｒｂ／Ｒａ（Ｗ“Ｗｂ）１７３ｆ６１，给药时闯以血药浓度达稳定为依据。２．３动物模型制作方法参照Ｌｏｎｇａ法Ｈ１并予改良制作大鼠脑缺血再灌注模型ｉ（１）线栓的制备：将真径０．１６５ｍｍ日本鱼线拉直固定于板上，放入考箱中加热使之变直。并将鱼线剪成４ｃｍ长的短线若干。其前端ｌ～２ｒａｍ用聚乙烯

5、醇浸泡后风干，在距聚乙烯醇端１．７ｃｍ处标记，放入生理盐水中备用。（２）缺血再灌注模型的制备：用水合氯醛（Ｏ．３ｍｌ／１００９）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定于手术板上，沿颈部正中切开皮肤，分离显露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，分离迷走神经后用手术线结扎颈总动脉近心端、颈外动脉。用大鼠动脉夹铗闭颈内动脉，颈总动脉分叉处穿线备用，在颈总动脉上两线之闻用眼科手术剪剪一小缺口，将鱼线涂有聚乙烯醇端由缺口插入颈总动脉和颈内动脉，松开动脉夹，将鱼线插入颅内，插入深度为１．７～２．Ｏｃｍ（插入线之远端离颈动脉分叉处

6、的距离）。结扎颈总动脉分叉处，缝合皮肤。２＾后再灌注时提拉鱼线至有阻力时止，长度约为ｌｃｒｔｌ。假手术组插入线栓的长度为０．５～１．Ｏｃｍ，其余步骤同模型组。２．４神经功能评分术后约４０～６０ｍｉｎ动物苏醒。按Ｂｅｄｅｒｓｏｎ评分标准【８１评分：０级（０分）：无神经功能障碍；ｌ级（１分）：提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面：２级（２分）：除了ｌ级体征外，向瘫痪侧推时感阻力较对侧明显降低；３级（３分）：除了以上体征外，大鼠爬行时向瘫痪侧旋转（追尾现象）。假手术组无神经功能障碍（０分）。缺血组１

7、分或１分以上者入选本实验。２．５标本采集及制作各组分别于缺血２＿Ｉｌ再灌注２２ｈ，用１０％水合氯醛按３００—４５０ｍｇ／ｋｇ再７遵义医学院２００６届硕士学位论文他汀类药物对大鼠脑缺血再灌注后ＮＯＳ等的影响次麻醉大鼠，开胸暴露心脏，分离升主动脉，穿线备用，经右心室穿刺取血２～３ｍｌ，分离留取血清于－７０口低温冰箱保存，待检测ＳＯＤ和ＭＤＡ。取血后立即经升主动脉快速灌注生理盐水，剪开左右心耳（同时钳夹胸主动脉），直至右心房流出液清亮为止。然后用４％多聚甲醛（ＰＨ７．４的磷酸盐缓冲液配制）１５０ｍｌ灌注固定

8、，断头取脑。冠状切取视交叉后部脑组织，将大脑置于４％甲醛中固定２－３ｗ。２．６ＨＥ染色和免疫组织化学染色冠状切取大脑视交叉后部位组织，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成５９ｍ厚的脑组织切片，进行ＨＥ染色，封片，光镜下观察病灶区组织病理变化。另制成７ｕｍ厚的脑组织切片粘于多聚赖氨酸处理后的玻片上，室温保存备用。进行免疫组织化学染色。２．７检测方法：（１）ＳＯＤ和ＭＤＡ检测方法：化学比色法，ＭＤＡ采用硫代巴比妥酸法测定血清中ＭＤＡ的