噬菌体展示技术操作步骤

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1、筛选多肽试剂及配制（1）LB培养基：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5g溶于去离子水，至1L，高压灭菌，4℃保存。（2）IPTG/Xgal：称取1.25gIPTG，1.0gXgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。（3）LB/IPTG/Xgal平板：1LLB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1mlIPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。（4）顶层琼脂糖凝胶：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5gMgCl2.6H2O1g琼脂糖7g溶于适量去离子水中，至总体积为1L。高压灭菌，分装为

2、50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。（5）2×M9盐：Na2HPO412gKH2PO46gNaCl1gNH4Cl2g溶于适量去离子水中，至终体积为1L。（6）小型平板：500ml2×M9盐500ml3%琼脂粉20ml20%葡萄糖2ml1MMgSO40.1ml1MCaCl21ml硫胺素（10mg/ml）在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。平板储存于4℃。（7）封闭缓冲液：0.1MNaHCO3(PH8.6)5mg/mlBSA0.02%NaN3过滤除菌，储存于4℃。（8）TBS：5

3、0mMTris-HCl(PH7.5)150mMNaCl高压灭菌，室温储存。（9）PEG/NaCl：20%（w/v）聚乙二醇-80002.5MNaCl高压灭菌，室温储存。（10）碘化物缓冲液：10mMTris-HCl(PH8.0)1mMEDTA4MNaI室温避光保存。操作步骤：1．第一天（1）以0.1MNaHCO3(PH8.6)制备100μg/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。（2）在每孔内加入1.5ml靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。（3）在

4、湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。2．第二天（4）将ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至10mlLB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20mlLB培养基的250ml锥形瓶中（比例为1：100）。37℃剧烈振摇。（5）将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1h。（6）去除包被液。用TBST（TBS+0.1%Tween-20）快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。按照步骤5的方法去除洗涤液（也可利用自动洗板机洗涤）。洗涤

5、要迅速，避免平皿干燥。（注意每次更换纸巾，以避免交叉污染）。（7）用1mlTBST稀释4×1010噬菌体（10μl原库），加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。（8）以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。（9）以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。（10）用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体（0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白（100μg/ml）的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10-60min。将洗脱液转入微量离心管中。（10a

6、）或使用通用缓冲液，0.2M甘氨酸-盐酸（PH2.2），1mg/mlBSA。轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μl1MTris-HCl(PH9.1)中和。（11）取小量洗脱液（1μl）测定滴度，如果有必要，可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序（见后续操作）。（未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1：100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5h，进入步骤13）。（12）将剩余

7、的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入20mlER2537培养物中（对数早期），37℃剧烈振摇孵育4.5h。（13）将培养物转入微量离心管中，4℃，10000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。（14）将80%的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌体至少60min或过夜。1．第三天（15）4℃，10000转离心PEG的沉淀物15min，倾去上清，再次离心，吸去多余的上清。（16）用1mlTBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4℃离心5min使残留的细胞沉淀。（17）将上清转入新的离心管中，用1

8、/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15-60min。4℃离心10min，弃上清，再次短暂离心，用微量枪头吸去残留的上清。（18）用200μlTBS，0.02%NaN3悬浮沉淀物，离心1min，将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。（19