(09综合实验)壳聚糖微球的制备

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1、壳聚糖微球固定木瓜蛋白酶的研究1壳聚糖微球的制备壳聚糖属多糖类物质，是一种生物相容性好、无毒、廉价易得的天然高分子生物材料。壳聚糖易于进行化学改性，引入新的功能团，尤其是壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂(戊二醛)很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地固定在壳聚糖分子上。因此，壳聚糖是一类性能优良的酶固定化载体。壳聚糖在酸性条件下溶解、碱性条件下沉淀，在较低浓度的NaOH溶液中，壳聚糖微球在还未完全沉淀成球以前就己经塌陷，壳聚糖分子堆砌在一起，导致所成微球形态不好、强度较差、表面厚度不均一、凸凹不平、不能形成

2、良好的结构。随着NaOH浓度的增加，壳聚糖微球迅速成形，容易形成厚度均一、形态较好、韧性好的微球，此时微球表面被撑起，呈现出壳聚糖自身的疏松多孔结构。不过当其浓度达到20%，又不能成球，因为浓度太高来不及成球就己经粘连在一起，形成一片絮状物。所以适宜的NaOH浓度范围为7.5-15%。在NaOH溶液中加入乙醇后形成的壳聚糖微球更加圆润，而且随着溶液中乙醇含量的增加，壳聚糖微球的机械强度得到了加强，韧性越来越好，但当乙醇浓度达到50%时，球表面产生了很多气泡，微球悬浮在溶液中，不利于操作。故选取2.0%壳聚糖滴入10%

3、NaOH:乙醇=4:1的溶液中为较好的成球条件。壳聚糖2.0g溶于100mL、1.0%乙酸溶液中((20℃条件下)充分溶解，将壳聚糖溶液逐滴滴入250mL混合液(10.0%NaOH与95%乙醇，体积比为4:1)，得粒度均匀、形状规整的壳聚糖微球，过滤收集壳聚糖微球，再用蒸馏水洗涤至中性，湿态保存。2壳聚糖微球的交联：将1.0g壳聚糖微球置于100mL蒸馏水中，加入一定体积（0.6、1.0、1.4mL）的25%戊二醛，30℃下恒温振荡2.0hr，用大量水反复洗涤，以去除残留的戊二醛溶液，即得壳聚糖微球载体。3木瓜蛋白酶

4、的固定化称取上述壳聚糖微球载体，加入10mL的0.lmol/L磷酸缓冲溶液(pH=6.0、7.0、8.0)和10mL木瓜蛋白酶溶液（浓度为：0.5、1.0、1.5mg.mL-1），30℃下恒温振荡一定时间（3.0、4.0、5.0hr）。弃去上层溶液，用大量水反复洗涤载体，即得固定化木瓜蛋白酶。4酶活力测定在试管中加入1mL的0.lmol/L磷酸缓冲溶液(pH=7.0，内含5mmol/L半胱氨酸和lmmol/LEDTA),3mL2%酪蛋白溶液(pH=7.0)，37℃水浴中预5min，然后加入一定量的酶，于37℃反应30

5、min后加入5mL10%三氯乙酸溶液，振荡后于37℃放置1Omin，过滤，测滤液在275nm处的吸光度。空白管则先加入TCA溶液，再加酪蛋白溶液，其余与样品管相同。以上酶活力测定过程中都作三个平行样。酶活力单位(U)规定为每lOmin内增加0.1个吸收单位对应的酶量。5戊二醛浓度对固定化酶活力的影响2当戊二醛浓度增大时，壳聚糖微球表面上的氨基连接的戊二醛增多，相应地与戊二醛交联的酶分子增多，所以固定化酶的活力增加。但是戊二醛既是固定化反应的交联剂，又是酶的变性剂，会使交联壳聚糖球上的悬挂醛基量提高，固定化过程反应剧烈

6、，悬挂醛基与酶蛋白分子上的氨基发生多点结合，酶分子过多，造成过于拥挤，改变了原有的高级结构，影响酶的活性。而且过量的戊二醛能使壳聚糖分子内的氨基交联，使壳聚糖的孔隙减小，增大了固定化酶的空间位阻。所以导致固定化酶的活力随着戊二醛浓度的增加反而逐渐降低了。6加酶量对固定化酶活力的影响交联后的壳聚糖，其活性基团是一定的，因而在其结合位点未饱和之前，所得固定化酶的活力随加酶量的增加而增大；当结合位点达到饱和后，增大加酶量不能增加固定化酶的活力。7pH值对固定化酶活力的影响游离酶的活性受pH的影响，pH还对酶分子的表面电荷有

7、影响，因此，pH可能对载体和酶的交联反应产生影响。8固定化反应时间对固定化酶活力的影响随着固定化反应时间的延长，固定化酶活力随之增大；当固定化反应完成，载体上的结合位点达到饱和，再延长时间，固定化酶活力不变。9固定化条件优化表一正交试验因素水平表因素水平1水平2水平3A戊二醛浓度（%）B酶液浓度（mg/mL）C交联反应pHD交联反应时间0.150.56.03.00.251.07.04.00.351.58.05.0表二正交试验方案与实验结果分析实验号ABCD固定化酶活力固定化酶活力回收率123456789K1K2K3极

8、差R1112223331231231231232313121233122312